Este protocolo descreve o estabelecimento de um novo modelo de camundongo para estudar o fungo da pele, malassezia, e sua interação com a pele dos mamíferos in vivo. Em contraste com abordagens in vitro, este modelo de infecção permite o estudo de mecanismos imunológicos inatos e adaptativos contra malassezia em plena complexidade e de forma específica do tecido. A malassezia está associada a vários distúrbios da pele, como dermatite atópica.
Entender a resposta imune ao fungo pode fornecer novas estratégias para tratar doenças inflamatórias inflamatórias tão frequentes e crônicas da pele. A infecção experimental de pele com Malassezia fornece um modelo muito aguardado para estudar como os fungos commensais da pele modulam o sistema imunológico e, assim, impactam o curso e a gravidade de vários distúrbios da pele. Para preparar um inóculo malassezia adicione 10 mililitros de mDixon líquido médio e três a cinco colônias individuais malassezia de uma placa de ágar mDixon a um frasco estéril de 100 mililitros Erlenmeyer.
Em seguida, coloque o frasco a 30 graus Celsius e 180 rotações por minuto durante 48 a 96 horas. Quando a cultura for cor de creme e turva, transfira dois mililitros da cultura em um tubo de microcentrífugo estéril de dois mililitros e sedimente a levedura por centrifugação. Resuspend a pelota em um mililitro de PBS para uma segunda centrifugação seguida de resuspensão em um mililitro de PBS fresco com tubulação vigorosa.
Diluir a suspensão malassezia 20 a 50 vezes com PBS para garantir que a leitura esteja entre 0,1 e um e medir o OD 600 em um espectrômetro. Aliquot um volume da suspensão malassezia em PBS que corresponde a um OD 600 de quatro em um tubo estéril de dois mililitros por animal para ser infectado e sedimentar a levedura por centrifugação. Em seguida, resuspend as pelotas em 200 microliters de azeite nativo.
Para iniciar uma infecção pela Malassezia, confirme a falta de resposta ao reflexo do pedal em um camundongo C57 Black6 fêmea anestinado de seis a oito semanas de idade e aplique pomada aos olhos do animal. Use uma pinça para medir a espessura de duas áreas diferentes de ambas as orelhas para permitir o cálculo da espessura média por orelha. Em seguida, aplique um pequeno pedaço de fita na pele de uma orelha antes de remover rapidamente a fita da pele da orelha cinco vezes usando um novo pedaço de fita cada vez.
Após a desmontagem, use uma pipeta estéril para aplicar 100 microlitadores da suspensão do azeite malassezia ao lado dorsal de cada orelha e injete 200 microliters de solução de glicose estéril e pré-armada de 2%subcutânea na dobra nucal para suportar o metabolismo e a reidratação. Em seguida, deixe o rato se recuperar em uma almofada de aquecimento por 30 minutos com monitoramento antes de devolver o animal à sua gaiola. Nos pontos de tempo experimentais apropriados, use uma pinça para medir duas áreas diferentes de cada orelha de rato para permitir o cálculo da espessura média por orelha.
Para medir a carga fúngica na pele infectada, adicione 500 microliters de 0,05% NP40 em água destilada e uma bola de aço de cinco mililitros autoclavados de diâmetro para um tubo de microcentrifuuge de dois mililitros por orelha e pese cada tubo em um equilíbrio. Em seguida, colde as orelhas de cada animal na base e coloque os tecidos em tubos individuais de NP40. Pesar cada tubo na balança para determinar o peso de cada amostra de ouvido antes de homogeneizar os tecidos auditivos por seis minutos a 25 Hertz.
Em seguida, distribua 100 microlitadores de cada amostra em placas de ágar mDixon e distribua as suspensões de forma homogênea através do ágar antes de sua incubação de cabeça para baixo a 30 graus Celsius. Aqui são mostradas imagens representativas para o crescimento de sympodialis malassezia em mDixon líquido médio e no ágar mDixon, como demonstrado. Um aumento na espessura da orelha pode ser observado após a aplicação de furfur malassezia na pele que foi rompida em comparação com a pele não perturbada de camundongos c57 black6 tipo selvagem.
De fato, a quantificação do aumento da espessura da orelha ao longo do tempo revela que a mudança na espessura é significativa em comparação com a pele tratada pelo veículo. Além disso, a carga fúngica na pele do ouvido no segundo dia após a infecção com paquidermatis malassezia está 100 a 1000 vezes acima do limite de detecção. Malassezia tende a formar agregados e não é facilmente suspensível.
Portanto, garanta a homogeneização da suspensão do fungo do óleo por vórtice extensivo. Leituras adicionais podem incluir, histologia para determinar a patologia da pele e o isolamento de células imunes da pele e linfonodos drenantes para investigar a resposta imune antifúngica. Esse modelo abre as oportunidades para estudar a resposta imune contra malassezia e investigar o papel do fungo como commensal no contexto de vários distúrbios da pele.
As espécies malassezia são classificadas como organismos BSL-2 em alguns países. Certifique-se de seguir a regulamentação de suas autoridades locais e usar as medidas de segurança adequadas.
