このプロトコルは、皮膚真菌、マラセチア、および生体内の哺乳類の皮膚との相互作用を研究するための新しいマウスモデルの確立を記述する。インビトロアプローチとは対照的に、この感染モデルは、マラセチアに対する自然および適応免疫機構を完全な複雑さで、組織固有の方法で研究することを可能にする。マラセチアは、アトピー性皮膚炎などの様々な皮膚疾患に関連しています。
真菌に対する免疫応答を理解することは、このような頻繁かつ慢性の炎症性皮膚疾患を治療するための新しい戦略を提供するかもしれない。マラセチアによる実験的皮膚感染は、皮膚の真菌が免疫系を調節し、それによって様々な皮膚疾患の経過および重症度にどのように影響するかを研究するための待望のモデルを提供する。マラセチア接種を調製するには、mDixon寒天プレートから無菌100ミリリットルのエルレンマイヤーフラスコに液体mDixon培地10ミリリットルと3〜5個のマラセチアコロニーを加える。
その後、フラスコを摂氏30度、毎分180回転に48~96時間置きます。培養液がクリーム色で濁っているとき、培養物の2ミリリットルを無菌の2ミリリットルのミクロ遠心チューブに移し、遠心分離によって酵母を沈下する。2回目の遠心分離のためにPBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、続いて活発なピペット処理で新鮮なPBSの1ミリリットルで再懸濁を行う。
マラセチア懸濁液をPBSで20~50回希釈し、読み取り値が0.1~1回であることを確認し、分光計でOD 600を測定します。アリコートは、4つのOD600に対応するPBSのマラセチア懸濁液の体積を、感染させ、遠心分離によって酵母を沈下させる動物1匹につき1つの無菌2ミリリットルチューブに相当する。その後、天然オリーブオイルの200マイクロリットルでペレットを再中断します。
マラセチア感染を開始するには、6〜8週齢の雌C57 Black6マウスに麻酔をかけたペダル反射への応答の欠如を確認し、動物の目に軟膏を塗布する。キャリパーを使用して、耳の平均厚さの計算を可能にするために、両方の耳の2つの異なる領域の厚さを測定します。その後、1つの耳の皮膚に小さなテープを貼ってから、毎回新しいテープを使用して耳の皮膚からテープを5回素早く取り出します。
ストリッピング後、無菌ピペットを使用して、各耳の後側にマラセチアオリーブオイル懸濁液100マイクロリットルを塗布し、200マイクロリットルの無菌を注入し、2%グルコース溶液をニューカルフォールドに皮下に注入して代謝と水分補給をサポートします。その後、マウスは、そのケージに動物を返す前に、監視と加熱パッド上で30分間回復することができます。適切な実験時間点で、キャリパーを使用して各マウスの耳の2つの異なる領域を測定し、耳あたりの平均厚さを計算することができます。
感染した皮膚の真菌の負担を測定するには、蒸留水に無菌0.05%NP40の500マイクロリットルを加え、1耳当たり2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに5ミリリットル直径のスチールボールをオートクレーブし、各チューブのバランスをとります。次に、各動物の耳をベースに収穫し、組織をNP40の個々の管に入れます。各チューブの重さをバランスに計り、25ヘルツで耳組織を6分間均質化する前に、各耳サンプルの重量を決定します。
その後、各サンプルの100マイクロリットルをmDixon寒天プレートに分配し、30°Cで逆さまのインキュベーションの前に寒天全体に均一に懸濁液を分配します。ここで示されているように液体mDixon培地およびmDixon寒天でマラセチアシンポディアリスの成長のための代表的な画像が示されている。野生型C57 Black6マウスの非摂動皮膚と比較して、バリアが破壊された皮膚へのマラセチア・フルファーの適用後に耳の厚さの増加が観察される。
実際、時間の経過に応じて耳の厚さの増加の定量化は、厚さの変化が、治療された皮膚の車両と比較して有意であることを明らかにする。また、マラセチアパチ皮膚症に感染した2日目の耳皮膚における真菌負担は検出限界を100~1000倍上回る。マラセチアは凝集体を形成する傾向があり、容易に中断することはできません。
従って、広範囲のボルテックスによる油菌懸濁液の均質化を確実にする。追加の読み出しには、皮膚病理および皮膚からの免疫細胞の単離を決定する組織学およびリンパ節を排出して抗真菌性免疫応答を調査することが含まれる。このモデルは、マラセチアに対する免疫応答を研究し、様々な皮膚疾患の文脈における真菌の役割を調べる機会を開く。
マラセチア種は、いくつかの国でBSL-2生物に分類されます。地方自治体の規制に従い、適切な安全対策を講じてください。
