Ce protocole décrit l’établissement d’un nouveau modèle de souris pour étudier le champignon de la peau, Malassezia, et son interaction avec la peau des mammifères in vivo. Contrairement aux approches in vitro, ce modèle d’infection permet l’étude des mécanismes immunitaires innés et adaptatifs contre la Malassezia dans toute la complexité et d’une manière spécifique aux tissus. La malassezia est associée à divers troubles de la peau, tels que la dermatite atopique.
Comprendre la réponse immunitaire au champignon peut fournir de nouvelles stratégies pour traiter ces maladies inflammatoires fréquentes et chroniques de la peau. L’infection expérimentale de peau avec Malassezia fournit un modèle tant attendu pour étudier comment les champignons proportionnels de peau modulent le système immunitaire et ont ainsi un impact sur le cours et la sévérité de divers désordres de peau. Pour préparer un inoculum Malassezia ajouter 10 millilitres de liquide mDixon moyen et trois à cinq colonies individuelles Malassezia d’une plaque d’agar mDixon à un stérile 100 milliliter Erlenmeyer flacon.
Placez ensuite le flacon à 30 degrés Celsius et 180 rotations par minute pendant 48 à 96 heures. Lorsque la culture est de couleur crème et trouble, transférer deux millilitres de la culture dans un tube stérile de microcentrifugeuse de deux millilitres et sédimenter la levure par centrifugation. Resuspendez la pastille dans un millilitre de PBS pour une deuxième centrifugation suivie d’une resuspension dans un millilitre de PBS frais avec pipetting vigoureux.
Diluer la suspension Malassezia 20 à 50 fois avec PBS pour s’assurer que la lecture se situe entre 0,1 et une et mesurer l’OD 600 sur un spectromètre. Aliquot un volume de la suspension Malassezia en PBS qui correspond à un OD 600 de quatre dans un tube stérile de deux millilitres par animal à infecter et sédimenter la levure par centrifugation. Puis réutilisez les granulés dans 200 microlitres d’huile d’olive indigène.
Pour déclencher une infection à Malassezia, confirmez un manque de réponse au réflexe de la pédale chez une souris C57 Black6 femelle anesthésiée de six à huit semaines et appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal. Utilisez un étrier pour mesurer l’épaisseur de deux zones différentes des deux oreilles pour permettre le calcul de l’épaisseur moyenne par oreille. Appliquez ensuite un petit morceau de ruban adhésif sur la peau d’une oreille avant d’enlever rapidement le ruban de la peau de l’oreille cinq fois à l’aide d’un nouveau morceau de ruban adhésif à chaque fois.
Après le décapage, utiliser une pipette stérile pour appliquer 100 microlitres de la suspension d’huile d’olive Malassezia sur le côté dorsale de chaque oreille et injecter 200 microlitres de solution stérile et préchauffée de 2% de glucose sous-cutanée dans le pli nuchal pour soutenir le métabolisme et la réhydratation. Ensuite, laissez la souris récupérer sur un coussin chauffant pendant 30 minutes avec surveillance avant de retourner l’animal dans sa cage. Aux points de temps expérimentaux appropriés, utilisez un étrier pour mesurer deux zones différentes de chaque oreille de souris pour permettre le calcul de l’épaisseur moyenne par oreille.
Pour mesurer la charge fongique de la peau infectée, ajoutez 500 microlitres de 0,05 % NP40 stérile dans de l’eau distillée et une boule d’acier autoclavée de cinq millilitres de diamètre à un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres par oreille et pesez chaque tube sur un équilibre. Ensuite, récoltez les oreilles de chaque animal à la base et placez les tissus dans des tubes individuels de NP40. Pesez chaque tube sur la balance pour déterminer le poids de chaque échantillon d’oreille avant d’homogénéiser les tissus auditifs pendant six minutes à 25 Hertz.
Ensuite, distribuez 100 microlitres de chaque échantillon sur des plaques d’agar mDixon et distribuez les suspensions de façon homogène à travers l’agar avant leur incubation à l’envers à 30 degrés Celsius. Ici, des images représentatives pour la croissance de Malassezia sympodialis dans le milieu mDixon liquide et sur l’agar mDixon comme démontré sont montrées. Une augmentation de l’épaisseur de l’oreille peut être observée après l’application de furfur Malassezia à la peau qui a été perturbée par rapport à la peau non perturbée des souris sauvages de type C57 Black6.
En effet, la quantification de l’augmentation de l’épaisseur de l’oreille au fil du temps révèle que le changement d’épaisseur est significatif par rapport à la peau traitée par le véhicule. En outre, la charge fongique dans la peau de l’oreille le deuxième jour après l’infection par Malassezia pachydermatis est 100 à 1000 fois supérieure à la limite de détection. Malassezia a tendance à former des agrégats et n’est pas facilement suspendable.
Par conséquent, assurer l’homogénéisation de la suspension des champignons d’huile par vortex étendu. D’autres readouts peuvent inclure, histologie pour déterminer la pathologie de peau et l’isolement des cellules immunisées de la peau et des ganglions lymphatiques drainants pour étudier la réponse immunisée antifongique. Ce modèle ouvre la possibilité d’étudier la réponse immunitaire contre malassezia et d’étudier le rôle du champignon en tant que proportionnel dans le contexte de divers troubles de la peau.
Les espèces de Malassezia sont classées comme organismes BSL-2 dans certains pays. Assurez-vous de suivre la réglementation de vos autorités locales et d’utiliser les mesures de sécurité appropriées.
