Die einfache und kostengünstige Methode, die wir MDR nennen, ermöglicht es Ihnen, angereicherte Populationen von Pachyten-Spermatozyten, runden Spermaatiden und länden Spermaatiden aus Maushoden zu isolieren. Der Hauptvorteil der MDR-Methode ist ihre Einfachheit. Sie benötigen nur Standard-Laborgeräte, die in den meisten biomedizinischen Forschungslabors verfügbar sind.
Das MDR-Protokoll eignet sich hervorragend für Forscher, die funktionelle Studien an männlichen Keimzellen machen. Zum Beispiel Gruppen, die Spermatogenese studieren, Faktoren, die die männliche Fruchtbarkeit beeinflussen, sowie väterliche epigenetische Vererbung. Für die MDR-Methode ist ein minimales Ausgangsmaterial erforderlich.
Und in der Tat, wir erhalten routinemäßig eine gute Menge an Zellen mit nur einer erwachsenen männlichen Maus. Beginnen Sie mit der Einrichtung der notwendigen Ausrüstung und Reagenzien. Stellen Sie ein Wasserbad auf 37 Grad Celsius und einen Zellkultur-Inkubator die 34 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit.
Legen Sie einen Rohrrotator in den Inkubator. Bereiten und beschriften Sie die entsprechende Menge an Mikroskopie-Glasgrollen, dann ziehen Sie einen Ring von etwa einem Zentimeter Durchmesser mit einem Fettstift, und lassen Sie das Fett trocknen. Wenn Sie bereit sind, das Tier zu sezieren, sprühen Sie den ventralen Bauch der Maus mit 70% Ethanol und verwenden Sie eine Schere, um eine V-Form öffnung in der Bauchbeckenhöhle zu machen.
Ziehen Sie das epididymale Fettpolster mit Zangen, lokalisieren Sie die Hoden und entfernen Sie sie mit einer Schere, um sicherzustellen, dass die Tunika albuginea nicht gestört wird. Legen Sie die Hoden auf eine sechs Zentimeter lange Petrischale mit 1X KREBS. Entkapseln Sie die Hoden und entsorgen Sie die Tunika albuginea, dann die seminiferen Tubuli leicht zu zerstreuen, indem Sie sie sanft mit Zangen auseinander necken.
Übertragen Sie sie in eine 50 Milliliter konische Röhre mit zwei Milliliter frisch zubereiteter Kollagennaselösung. Die Tubuli im 37 Grad Celsius Wasserbad drei Minuten lang bebrüten und sanft durch Schaukeln aufregen. Dann mindestens 40 Milliliter warmes 1X KREBS hinzufügen und die Tubuli bei Raumtemperatur sedimentieren lassen.
Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie die Wäsche noch einmal. Fügen Sie 25 Milliliter frisch zubereitete Trypsin-Lösung hinzu. Legen Sie das Rohr auf den Rotator im Inneren des Zellkultur-Inkubators und lassen Sie es dort für 15 bis 20 Minuten, drehen Sie bei ca. 15 U/min.
Sporadisch die Tubuli überprüfen. Sobald die Lösung trüb wird und nur noch kleine Teile der Tubuli übrig bleiben, legen Sie die Röhre auf Eis und fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort. Filtern Sie die Lösung durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb in eine neue 50-Milliliter-Konustube auf Eis.
Dann zentrifugieren Sie es bei 600 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, um die Zellen zu pellet. Gießen Sie den Überstand vorsichtig aus und tippen Sie auf das Zellpellet, um die Zellen im Rest des 1X KREBS wieder aufzuhängen. Fügen Sie den resuspendierten Zellen mindestens 40 Milliliter kaltes 1X KREBS hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation.
Setzen Sie die Zellen wieder aus, indem Sie auf das Rohr tippen. Dann eine Pipette-Spitze auf eine 1 Milliliter Pipette montieren und so schneiden, dass die Blende etwa drei Millimeter durchmesser ist. Addieren Sie bis zu drei Milliliter von 0,5%BSA in KREBS.
Setzen Sie die Zellen wieder aus, indem Sie nach oben und unten pfeifen, um Blasen zu vermeiden. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40-Mikrometer-Sieb und laden Sie die Zellen sofort auf den BSA-Gradienten. Sie müssen eine homogene Einzelzellsuspension erhalten, bevor Sie die Zellen auf den Gradienten laden.
Verklumpte Zellen sedimentieren schneller, stören Ihren Gradienten und verunreinigen die Fraktionen. Richten Sie eine 50 Milliliter-Röhre vertikal auf Eis ein, um sicherzustellen, dass es möglich ist, eine Seite des Rohres zu sehen. Dann etwa fünf bis zehn Millimeter von der Spitze einer zehn Milliliter serologischen Pipette schneiden und auf einem Pipettenregler montieren.
Pipetten Sie fünf Milliliter der 5%BSA-Lösung in den Boden des 50-Milliliter-Rohrs. Berühren Sie vorsichtig die Oberfläche der 5%-Lösung mit der Schnittspitze der Pipette und schichten Sie langsam fünf Milliliter 4%BSA-Lösung auf die 5%-Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit anderen BSA-Lösungen, um einen Gradienten von 5% bis 1%BSA zu erhalten.
Zwischen den Layern sollte eine klare Linie sichtbar sein. Dann die Einzelzellenaufhängung vorsichtig auf den Gradienten laden, ohne sie zu stören. Lassen Sie die Zellen anderthalb Stunden durch den Gradienten sedimentieren.
Mit einer geschnittenen Pipettenspitze die Ein-Milliliter-Fraktionen sorgfältig in separate 1,5-Milliliter-Rohre sammeln und auf Eis lagern, um sicherzustellen, dass die Rohre in der Reihenfolge nummeriert werden, in der sie gesammelt wurden. Zentrifugieren Sie die Keimzellfraktionen bei 600 x g zehn Minuten bei vier Grad Celsius. Dann achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören, entsorgen Sie den größten Teil des Überstandes und suspendieren Sie die Zellen, indem Sie das Rohr streichen.
Fügen Sie jedem Rohr einen Milliliter eiskalten 1X KREBS Puffer hinzu und wiederholen Sie die Zentrifugation. Entsorgen Sie den größten Teil des Überstandes, lassen Sie etwa 100 Mikroliter zurück und setzen Sie das Zellpellet sorgfältig wieder auf. Um die Zellfraktionen zu analysieren, beginnen Sie mit der Pipettierung von 20 Mikrolitern 4%Paraformaldehyd in jedem Fettstiftring auf einem nummerierten Mikroskop-Dia.
Fügen Sie sofort zwei Mikroliter der resuspendierten Zellen aus dem entsprechenden Bruch hinzu. Dann trocknen Sie die Rutschen bei Raumtemperatur für mindestens eine Stunde. Spülen Sie die Dias einmal mit PBS und verwenden Sie ein Montagemedium mit DAPI, um die Dias zu montieren.
Analysieren Sie jeden Dia unter einem Fluoreszenzmikroskop, um abzuschätzen, welcher bestimmte Keimzelltyp in jeder Fraktion angereichert ist. Sobald eine Probe aus jeder Fraktion für die Mikroskopie entnommen wurde, fügen Sie jedem Bruch einen Milliliter eiskaltes 1X KREBS hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen zehn Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 600 bis 13000 x g. Entfernen und verwerfen Sie den Überstand, und fahren Sie mit der bevorzugten Downstream-Analyse fort.
Dieses Protokoll eignet sich besonders gut zur Anreicherung von runden Spermien. In den Fraktionen zwei, drei und vier wurde eine Anreicherung über 90 % erreicht. Länder Spermaatien neigen dazu, auf dem Gradienten zu bleiben und wurden mit der ersten Fraktion gesammelt.
Aufgrund ihrer großen Größe sedimentieren pachytene Spermatozyten schneller und wurden zuletzt gesammelt. Die Anreicherung betrug in den Fraktionen 14 und 15 rund 75 %. Die gesamtrna, die aus der Mehrheit der Fraktionen gewonnen wurde, reichte von 0,5 bis 2,5 Mikrogramm, genug für nachgeschaltete RNA-Analysen.
Die Menge an Protein, die aus jeder Fraktion gewonnen wurde, reichte in der Regel zwischen 20 und 140 Mikrogramm, was für mehrere westliche Flecken ausreicht. In diesem Protokoll reichten 10% der aus einzelnen Fraktionen gewonnenen Proteinlysate aus, um DDX4-, PIWIL1- und PIWIL2-Proteine auf einem Standard-Western-Blot eindeutig zu erkennen. Die Proteinmenge in einer Fraktion reichte auch für die Immunpräzipation mit einem Antikörper gegen PIWIL1 sowie für den Nachweis von koimmunpräzipiertem PIWIL2 aus.
Selbst für einen ersten Timer funktioniert dieses Protokoll sehr gut, solange Sie sicherstellen, dass die Vorbehandlung Ihrer Zellen gut ist und nichts Ihren Gradienten während der Sedimentation stört. Aus einer einzigen Maus erhalten Sie hoch angereicherte Zellen, die für verschiedene nachgeschaltete Analysen wie RT-PCR, RNA-Sequenzierung, Immunpräzipation und Western Blotting verwendet werden können. Während MDR nicht die einzige Methode zur Anreicherung männlicher Keimzellen ist, ist es ein sehr praktisches Werkzeug, da es keine spezielle Ausrüstung oder umfangreiches Training erfordert.
