La méthode simple et peu coûteuse que nous appelons MDR vous permet d’isoler les populations enrichies de spermatocytes pachytene, de spermatds ronds et d’allonger les spermatids des testicules de souris. Le principal avantage de la méthode MDR est sa simplicité. Vous n’avez besoin que d’équipement de laboratoire standard disponible dans la plupart des laboratoires de recherche biomédicale.
Le protocole MDR est idéal pour les chercheurs qui font des études fonctionnelles sur les cellules germinales masculines. Par exemple, les groupes qui étudient la spermatogenèse, les facteurs affectant la fertilité masculine, ainsi que l’héritage épigénétique paternel. Un matériau de démarrage minimal est nécessaire pour la méthode MDR.
Et en fait, nous obtenons régulièrement une bonne quantité de cellules en utilisant une seule souris mâle adulte. Commencez par mettre en place l’équipement et les reagents nécessaires. Réglez un bain d’eau à 37 degrés Celsius et un incubateur de culture cellulaire les 34 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité.
Placer un rotateur à tube à l’intérieur de l’incubateur. Préparer et étiqueter la quantité appropriée de glissières en verre de microscopie, puis dessiner un anneau d’environ un centimètre de diamètre avec un stylo à graisse, et laisser sécher la graisse. Lorsqu’il est prêt à disséquer l’animal, vaporiser l’abdomen ventral de la souris avec 70% d’éthanol et utiliser des ciseaux pour faire une ouverture de forme en V dans la cavité pelvienne abdominale.
Tirez sur la garniture épididymale de graisse avec des forceps, localisez les testicules et retirez-les avec des ciseaux, en s’assurant d’éviter de déranger l’albuginea de tunica. Déposer les testicules sur une boîte de Pétri de six centimètres contenant 1X KREBS. Décapsuler les testicules et jeter le tunica albuginea, puis disperser légèrement les tubules séminifères en les taquinant doucement à l’aide de forceps.
Transférez-les dans un tube conique de 50 millilitres contenant deux millilitres de solution de collagène fraîchement préparée. Incuber les tubules dans le bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant trois minutes, les agitant doucement en berçant. Ajouter ensuite au moins 40 millilitres de KREBS 1X chaud et laisser les tubules sédimenter à température ambiante.
Retirer le surnatant et répéter le lavage une fois de plus. Ajouter 25 millilitres de solution trypsine fraîchement préparée. Placez le tube sur le rotateur à l’intérieur de l’incubateur de culture cellulaire et laissez-le là pendant 15 à 20 minutes, en tournant à environ 15 tours.
Vérifiez sporadiquement les tubules. Une fois que la solution devient trouble et que seuls de petits morceaux de tubules restent, placez le tube sur la glace et passez à l’étape suivante. Filtrer la solution à travers une passoire à cellules de 40 micromètres dans un nouveau tube conique de 50 millilitres sur la glace.
Puis centrifugez-le à 600 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour pelleter les cellules. Versez soigneusement le supernatant et appuyez sur la pastille cellulaire pour résuspendre les cellules dans le reste de la KREBS 1X. Ajouter au moins 40 millilitres de 1X KREBS froid aux cellules résuspendues et répéter la centrifugation.
Resuspendez les cellules en tapant sur le tube. Montez ensuite une pointe de pipette sur une pipette d’un millilitre et coupez-la de sorte que l’ouverture soit d’environ trois millimètres de diamètre. Ajouter jusqu’à trois millilitres de 0,5%BSA dans KREBS.
Resuspendre les cellules en pipetage de haut en bas, en s’assurant d’éviter les bulles. Filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire de 40 micromètres et procéder immédiatement au chargement des cellules sur le gradient BSA. Vous devez obtenir une suspension homogène d’une seule cellule avant de charger les cellules sur le gradient.
Les cellules agglutinées sédimentent plus rapidement, perturbant votre gradient et contaminant les fractions. Installez un tube de 50 millilitres verticalement sur la glace, en vous assurant qu’il est possible de voir un côté du tube. Puis couper environ cinq à dix millimètres de la pointe d’une pipette sérologique de dix millilitres et le monter sur un contrôleur pipette.
Pipette cinq millilitres de la solution 5%BSA dans le fond du tube de 50 millilitres. Touchez doucement la surface de la solution de 5% avec la pointe coupée de la pipette et couchez lentement cinq millilitres de solution BSA à 4%, en plus de la solution de 5%. Répétez cette procédure avec d’autres solutions BSA pour obtenir un gradient de 5% à 1%BSA.
Une ligne claire doit être visible entre les couches. Ensuite, chargez soigneusement la suspension d’une seule cellule sur le dessus du gradient sans la déranger. Laissez les cellules sédimenter à travers le gradient pendant une heure et demie.
À l’aide d’une pointe de pipette coupée, recueillir soigneusement les fractions d’un millilitre en tubes séparés de 1,5 millilitre et les conserver sur la glace, en s’assurant de numéroter les tubes dans l’ordre où ils ont été recueillis. Centrifuger les fractions des cellules germinales à 600 x g pendant dix minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, en prenant soin de ne pas déranger la pastille, jeter la plupart des supernatants et resuspendre les cellules en feuilletant le tube.
Ajouter un millilitre de tampon 1X KREBS froid à chaque tube et répéter la centrifugation. Jetez la plupart des supernatants, en laissant environ 100 microlitres et resuspendez soigneusement la pastille cellulaire. Pour analyser les fractions cellulaires, commencez par pipetting 20 microlitres de 4% paraformaldéhyde à l’intérieur de chaque anneau de stylo à graisse sur une diapositive de microscopie numérotée.
Ajoutez immédiatement deux microlitres des cellules résuspendues de la fraction correspondante. Ensuite, séchez les toboggans à température ambiante pendant au moins une heure. Rincez les diapositives une fois avec PBS et utilisez un support de montage avec DAPI pour monter les diapositives.
Analyser chaque diapositive au microscope à fluorescence pour estimer quel type particulier de cellule germinale est enrichi dans chaque fraction. Une fois qu’un échantillon de chaque fraction a été prélevé pour la microscopie, ajouter un millilitre de glace froide 1X KREBS à chaque fraction et centrifuger les cellules à 600 à 13000 x g pendant dix minutes à quatre degrés Celsius. Retirez et jetez le surnatant et poursuivez l’analyse en aval préférée.
Ce protocole fonctionne particulièrement bien pour enrichir les spermatatids ronds. L’enrichissement supérieur à 90 % a été réalisé en fractions deux, trois et quatre. Les spermatids allongés ont tendance à rester au-dessus du gradient et ont été recueillis avec la première fraction.
En raison de leur grande taille, les spermatocytes pachytene sédimentent plus rapidement et ont été recueillis en dernier. L’enrichissement était d’environ 75% en fractions 14 et 15. L’ARN total obtenu à partir de la majorité des fractions mentait de 0,5 à 2,5 microgrammes, ce qui était suffisant pour les analyses d’ARN en aval.
La quantité de protéines obtenue à partir de chaque fraction ment éloquée généralement de 20 à 140 microgrammes, ce qui est suffisant pour plusieurs taches occidentales. Dans ce protocole, 10 % des lysates protéiques dérivés de fractions simples étaient suffisants pour détecter clairement les protéines DDX4, PIWIL1 et PIWIL2 sur une tache occidentale standard. La quantité de protéine dans une fraction était également suffisante pour l’immunoprécipitation utilisant un anticorps contre PIWIL1 aussi bien que pour la détection du PIWIL2 coimmunoprecipitated.
Même pour une première fois, ce protocole fonctionne très bien tant que vous vous assurez que le pré-traitement de vos cellules est bon, et rien ne perturbe votre gradient pendant la sédimentation. À partir d’une seule souris, vous obtenez des cellules hautement enrichies, qui peuvent être utilisées pour différentes analyses en aval telles que RT-PCR, séquençage de l’ARN, immunoprécipitation et ballonnement occidental. Bien que le MDR ne soit pas la seule méthode pour enrichir les cellules germinales mâles, il s’agit d’un outil très pratique parce qu’il ne nécessite pas d’équipements spécialisés ou de formation approfondie.
