MDR dediğimiz basit ve ucuz yöntem, pachytene spermatositlerin zenginleştirilmiş popülasyonlarını, yuvarlak spermatidleri ve fare testislerinden uzamış spermatidleri izole etmenizi sağlar. MDR yönteminin en büyük avantajı basitliğidir. Çoğu biyomedikal araştırma laboratuvarında bulunan sadece standart laboratuvar ekipmanlarına ihtiyacınız vardır.
MDR protokolü erkek mikrop hücreleri üzerinde fonksiyonel çalışmalar yapan araştırmacılar için harika. Örneğin, spermatogenez inceleyen gruplar, erkek doğurganlığı etkileyen faktörler, hem de baba epigenetik kalıtım. MDR yöntemi için minimum başlangıç malzemesi gereklidir.
Ve aslında, biz rutin sadece bir yetişkin erkek fare kullanarak hücrelerin iyi miktarda elde. Gerekli ekipman ve reaktifler kurarak başlayın. 37 santigrat derece ve bir hücre kültürü kuluçka 34 derece santigrat, 5% karbondioksit ve% 95 nem için bir su banyosu ayarlayın.
Kuvöziçine bir tüp rotator yerleştirin. Hazırlamak ve mikroskopi cam slaytlar uygun miktarda etiket, sonra bir gres kalemi ile çapı yaklaşık bir santimetre lik bir halka çizmek ve gres kuru izin. Hayvanı incelemeye hazır olduğunuzda, farenin ventral karnını %70 etanol püskürtün ve karın pelvik boşluğunda V şeklinde bir açıklık sağlamak için makas kullanın.
Forseps ile epididymal yağ yastığı çekin, testisleri bulmak ve makas ile kaldırın, tunica albuginea rahatsız önlemek için emin olun. Testisleri 1X KREBS içeren altı santimetrelik petri kabına yerleştirin. Testisleri dekapsulate ve tuunica albuginea atın, sonra hafifçe forseps ile ayrı alay ederek seminiferous tübülleri dağıtmak.
Yeni hazırlanmış kollajenaz çözeltisi iki mililitre içeren 50 mililitrekonik tüp içine aktarın. 37 santigrat derece su banyosunda tübülleri üç dakika kuluçkaya yatırın, sallayarak hafifçe çalkalayın. Sonra sıcak 1X KREBS en az 40 mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında tortu tübüller sağlar.
Supernatant çıkarın ve yıkama bir kez daha tekrarlayın. Taze hazırlanmış tripsin çözeltisi 25 mililitre ekleyin. Hücre kültürü kuluçka içinde rotator üzerine tüp yerleştirin ve yaklaşık 15 rpm dönen, 15 ila 20 dakika orada bırakın.
Düzensiz boruları kontrol edin. Çözelti bulutlu hale geldikten sonra tübüllerin sadece küçük parçaları kalır, tüpü buza yerleştirin ve bir sonraki adıma geçin. Çözeltiyi 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek buz üzerinde 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe süzün.
Sonra 600 x g'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin ve hücreleri peletleyin. Supernatant'ı dikkatlice dökün ve 1X KREBS'nin geri kalanındaki hücreleri yeniden askıya almak için hücre peletine dokunun. Resuspended hücrelere en az 40 mililitre soğuk 1X KREBS ekleyin ve santrifüjü tekrarlayın.
Tüpü dokunarak hücreleri yeniden askıya alın. Sonra bir mililitrelik pipet üzerine bir pipet ucu monte ve diyafram çapı yaklaşık üç milimetre olacak şekilde kesti. KREBS'de üç mililitreye kadar %0,5 BSA ekleyin.
Yukarı ve aşağı borular tarafından hücreleri yeniden askıya, kabarcıklar önlemek için emin olun. Hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir süzgeçten filtreleyin ve hücreleri BSA degradesine yüklemeye hemen devam edin. Hücreleri degradeye yüklemeden önce homojen tek hücreli süspansiyon elde edinmelisiniz.
Kümelenmiş hücreler daha hızlı çökeltecek, degradenizi bozar ve kesirleri kirletir. 50 mililitrelik bir tüpü buz üzerinde dikey olarak ayarlayın, tüpün bir tarafını görmenin mümkün olduğundan emin olun. Sonra on mililitrelik serolojik pipet ucundan yaklaşık beş ila on milimetre kesip bir pipet denetleyicisi üzerine monte edin.
Pipet 50 mililitrelik tüpün altına 5% BSA çözeltisi beş mililitre. %5'lik çözeltinin yüzeyine pipetin kesme ucuyla hafifçe dokunun ve %5'lik çözeltinin üzerine %4 BSA çözeltisinin beş mililitresini yavaşça katlayın. %5 ila %1 BSA degradesi elde etmek için bu yordamı diğer BSA çözümleriyle tekrarlayın.
Katmanlar arasında net bir çizgi görülmelidir. Daha sonra tek hücreli süspansiyonu rahatsız etmeden degradenin üzerine dikkatlice yükleyin. Hücrelerin degradeden bir buçuk saat boyunca tortul geçmesine izin verin.
Kesme pipet ucu kullanarak, bir mililitrelik fraksiyonları ayrı 1,5 mililitrelik tüpler halinde dikkatlice toplayın ve buzüzerinde saklayın, tüpleri toplandıkları sırayla numaralandırın. Mikrop hücre fraksiyonlarını 600 x g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Daha sonra pelet rahatsız etmemeye özen, supernatant en atın ve tüp flicking hücreleri resuspend.
Her tüpe bir mililitre buz gibi soğuk 1X KREBS tamponu ekleyin ve santrifüjü tekrarlayın. Yaklaşık 100 mikrolitre bırakarak, supernatant çoğu atın ve hücre pelet dikkatle yeniden askıya. Hücre fraksiyonlarını analiz etmek için, numaralanmış bir mikroskopi slayt üzerinde her gres kalem halkası içinde% 4 paraformaldehit 20 mikrolitre pipetleme ile başlayın.
Hemen ilgili fraksiyondan resuspended hücrelerin iki mikrolitre ekleyin. Daha sonra slaytları oda sıcaklığında en az bir saat kurutun. Slaytları PBS ile bir kez durula ve slaytları monte etmek için DAPI ile montaj ortamı kullanın.
Bir floresan mikroskobu altında her slayt analiz belirli germ hücre tipi her fraksiyonu zenginleştirilmiş olduğunu tahmin etmek. Her bir fraksiyondan bir örnek alındıktan sonra, her fraksiyona bir mililitre buz soğuğu 1X KREBS ekleyin ve hücreleri 600 ila 13000 x g'de 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı çıkarın ve atın ve tercih edilen akış aşağı analizine devam edin.
Bu protokol özellikle yuvarlak spermatidlerin zenginleşmesi için iyi çalışır. %90'ın üzerindeki zenginleştirme iki, üç ve dört kesirlerde elde edilmiştir. Uzayan spermatidler degradenin üstünde kalma eğilimindedirler ve ilk fraksiyonu ile toplanırlar.
Onların büyük boyutu nedeniyle, pachytene spermatositler daha hızlı tortu ve son toplandı. Zenginleştirme 14 ve 15 kesirlerinde %75 civarındaydı. Kesirlerin çoğundan elde edilen toplam RNA 0,5 ile 2,5 mikrogram arasında değişmekteve rna analizleri için yeterlidir.
Her fraksiyondan elde edilen protein miktarı tipik olarak 20 ile 140 mikrogram arasında değişmektedir ve bu da birkaç Batı lı leke için yeterlidir. Bu protokolde, tek fraksiyonlardan elde edilen protein lisatlarının %10'u standart bir Batı lekesinde DDX4, PIWIL1 ve PIWIL2 proteinlerini net bir şekilde saptamak için yeterliydi. Bir fraksiyondaki protein miktarı, PIWIL1'e karşı antikor kullanımının yanı sıra koimmünopesipitated PIWIL2'nin saptanması için immünoprediyağış için de yeterliydi.
İlk zamanlayıcı için bile, hücrelerinizin ön tedavisinin iyi olduğundan ve sedimantasyon sırasında degradenizi hiçbir şeyin bozamadığından emin olduğunuz sürece bu protokol çok iyi çalışır. Tek bir fareden, RT-PCR, RNA dizilemesi, immünopresipitasyon ve Batı lekeleme gibi farklı downstream analizleri için kullanılabilen yüksek oranda zenginleştirilmiş hücreler elde elabilirsiniz. MDR erkek mikrop hücrelerini zenginleştirmek için tek yöntem olmasa da, herhangi bir özel ekipman veya kapsamlı eğitim gerektirmez, çünkü çok uygun bir araçtır.
