Простой и недорогой метод, который мы называем MDR позволяет изолировать обогащенные популяции пахитенов сперматозоидов, круглые сперматозоиды и удлиненные сперматозоиды из мышей яички. Основным преимуществом метода MDR является его простота. Вам нужно только стандартное лабораторное оборудование, которое доступно в большинстве биомедицинских исследовательских лабораторий.
Протокол MDR отлично подходит для исследователей, которые проводят функциональные исследования мужских зародышевых клеток. Например, группы, изучающие сперматогенез, факторы, влияющие на мужскую плодовитости, а также отцовское эпигенетическое наследование. Для метода MDR требуется минимальный стартовый материал.
И в самом деле, мы обычно получаем хорошее количество клеток, используя только один взрослый мужчина мыши. Начните с установки необходимого оборудования и реагентов. Установите ванну для воды до 37 градусов по Цельсию и инкубатор клеточной культуры 34 градусов по Цельсию, 5%углекислого газа и 95%влажности.
Поместите трубчатый ротатор внутри инкубатора. Подготовьте и обозначите соответствующее количество микроскопии стеклянными слайдами, затем нарисуйте кольцо диаметром около одного сантиметра с помощью смазаны ручкой и дайте смазке высохнуть. Когда готовы вскрыть животное, спрей брюшной полости мыши с 70% этанола и использовать ножницы, чтобы сделать V форму открытия в брюшной полости таза.
Потяните на эпидидимальной жировой площадке с типсами, найти яички и удалить их ножницами, убедившись, чтобы избежать тревожных туника альбугинеа. Поместите яички на шестиметровую чашку Петри, содержащую 1X KREBS. Decapsulate яички и отказаться от туника альбугинея, а затем слегка разогнать семенные трубочки, осторожно дразнить их друг от друга с типсами.
Перенесите их в 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую два миллилитров свежеприготовленного раствора коллагеназы. Инкубировать трубоубивания в 37 градусов по Цельсию водяной бане в течение трех минут, агитировать их осторожно, качая. Затем добавьте не менее 40 миллилитров теплого 1X KREBS и дайте трубоубий отложениям при комнатной температуре.
Снимите супернатант и повторите стирку еще раз. Добавьте 25 миллилитров свежеприготовленного трипсина раствора. Поместите трубку на ротатор внутри инкубатора клеточной культуры и оставьте ее там на 15-20 минут, вращаясь со 15 об/мин.
Время от времени проверяйте трубоубивания. Как только раствор станет мутным и останутся лишь мелкие кусочки трубоубей, поместите трубку на лед и перейти к следующему шагу. Фильтровать раствор через 40-метровый ситечко клеток в новую 50-миллилитровую коническую трубку на льду.
Затем центрифуга его на 600 х г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию, чтобы гранулировать клетки. Аккуратно вылейте супернатант и коснитесь клеточной гранулы, чтобы повторно использовать клетки в оставшейся части 1X KREBS. Добавьте не менее 40 миллилитров холодных 1X KREBS в перерасходные клетки и повторите центрифугу.
Повторное использование клеток путем нажатия трубки. Затем смонтировать наконечник пипетки на один миллилитр пипетки и сократить его так, что диафрагма составляет около трех миллиметров в диаметре. Добавьте до трех миллилитров 0,5%BSA в KREBS.
Resuspend клетки путем pipetting вверх и вниз, убедившись, чтобы избежать пузырьков. Фильтровать подвеску клетки через 40-метровый ситечко и немедленно приступить к загрузке клеток на градиент BSA. Ваш должен получить однородную одноклеточную подвеску перед загрузкой клеток на градиент.
Clumped клетки будут осадок быстрее, нарушая ваш градиент и загрязняющих фракций. Установите 50 миллилитровую трубку вертикально на льду, убедившись, что можно увидеть одну сторону трубки. Затем вырезать около пяти до десяти миллиметров от кончика десяти миллилитров серологического пипетки и установить его на контроллер пипетки.
Пипетт пять миллилитров раствора 5%BSA в нижней части 50 миллилитров трубки. Аккуратно коснитесь поверхности 5%-го раствора с разрезом кончика пипетки и медленно слой пять миллилитров 4%BSA решение поверх 5%-раствора. Повторите эту процедуру с другими решениями BSA, чтобы получить градиент от 5%до 1%BSA.
Между слоями должна быть видна четкая линия. Затем осторожно загрузите одноклеточную подвеску поверх градиента, не нарушая его. Пусть клетки отложений через градиент в течение полутора часов.
Используя наконечник выреза пипетки, тщательно соберите одну миллилитровую фракцию в отдельные 1,5 миллилитровые трубки и храните их на льду, убедившись, что про номер труб в порядке, если они были собраны. Центрифуга фракций зародышевых клеток на 600 х г в течение десяти минут при четырех градусах по Цельсию. Затем заботясь, чтобы не беспокоить гранулы, отказаться от большинства супернатантов и повторного перерасхода клеток, щелкая трубки.
Добавьте один миллилитр ледяного буфера 1X KREBS к каждой трубке и повторите центрифугу. Отбросьте большую часть супернатанта, оставив около 100 микролитров и тщательно перерасходовать клеточные гранулы. Чтобы проанализировать фракции клеток, начните с пипетки 20 микролитров 4%paraformaldehyde внутри каждого кольца ручки смазки на пронамеренном слайде микроскопии.
Немедленно добавьте два микролитров повторно натященных ячеек из соответствующей фракции. Затем высушите горки при комнатной температуре, по крайней мере один час. Промыть слайды один раз с PBS и использовать монтаж среды с DAPI для установки слайдов.
Проанализируйте каждый слайд под микроскопом флуоресценции, чтобы оценить, какой именно тип зародышевых клеток обогащается в каждой фракции. После того, как образец из каждой фракции был взят для микроскопии, добавить один миллилитр ледяного 1X KREBS к каждой фракции и центрифуги клетки вниз на 600 до 13000 х г в течение десяти минут при четырех градусах по Цельсию. Удалите и отбросьте супернатант и продолжайте предпочтительный анализ ниже по течению.
Этот протокол работает особенно хорошо для обогащения круглых сперматозоидов. Обогащение выше 90% было достигнуто в дробях два, три и четыре. Удлинение сперматозоидов, как правило, остаются на вершине градиента и были собраны с первой фракции.
Из-за их больших размеров, пахитен сперматозоиды отложений быстрее и были собраны в прошлом. Обогащение составило около 75% в фракциях 14 и 15. Общая РНК, полученная из большинства фракций, колебалась от 0,5 до 2,5 микрограммов, что достаточно для анализа РНК ниже по течению.
Количество белка, полученного из каждой фракции, как правило, варьировалось от 20 до 140 микрограммов, что достаточно для нескольких западных помарк. В этом протоколе 10% белковых лисатов, полученных из одиночных фракций, было достаточно, чтобы четко обнаружить белки DDX4, PIWIL1 и PIWIL2 на стандартной западной помарке. Количество белка в одной фракции было также достаточно для иммунопреципиентации с использованием антитела против PIWIL1, а также для обнаружения coimmunoprecipitated PIWIL2.
Даже для первого таймера, этот протокол работает очень хорошо до тех пор, как вы убедитесь, что предварительное лечение ваших клеток хорошо, и ничто не нарушает ваш градиент во время осадка. От одной мыши, вы получаете высокообогащеные клетки, которые могут быть использованы для различных анализов вниз по течению, таких как RT-PCR, РНК секвенирования, иммунопреципиентации и западной blotting. Хотя МЛУ не единственный метод обогащения мужских зародышевых клеток, он является очень удобным инструментом, поскольку он не требует каких-либо специализированных оборудования или обширной подготовки.
