Este protocolo está demostrando que ahora podemos determinar el efecto de los inhibidores migratorios en detalle en los modelos de cáncer 3D. La principal ventaja es la facilidad y el enfoque todo en uno con el que se puede llevar a cabo esta técnica. Esta técnica permite la evaluación de fármacos migrastáticos en la investigación del cáncer en un entorno 3D, permitiendo la prueba de fármacos en un entorno más relevante para el tumor.
Este método se puede aplicar a las pruebas de fármacos citotóxicos en el cáncer o, por ejemplo, para evaluar el efecto de la radiación en la proliferación del cáncer y la migración celular. Es útil practicar el paso de eliminación media y el reemplazo de colágeno con placas ordinarias de 96 pozos para tener confianza. Además, el entrenamiento en un microscopio confocal es esencial.
La demostración visual de esta técnica es fundamental para que los investigadores entiendan el manejo delicado requerido de los esferoides y su uso en la microscopía confocal. En el primer día de experimentación, tenga el medio de cultivo estándar, en este caso, U251, listo para la línea celular adecuada. En una capucha de cultivo de tejido, añadir 0,5 mililitros de trippsina en el cultivo para tripsinar las células cancerosas.
Contar las células cancerosas en un hemocitoómetro y diluir a una concentración de cinco veces 10 a las terceras células por mililitro. Mantenga las suspensiones celulares en tubos universales estériles claramente etiquetados. Resuspender las células por inversión suave para evitar el aglutinamiento celular.
Utilice una pipeta para añadir 200 microlitros del cultivo celular a cada pozo en una placa de 96 pozos. Añadir 200 microlitros de 1X PBS a cada pozo vacío para evitar la evaporación. Incubar las células en una incubadora a 37 grados centígrados.
Después de 24 horas, revise las células mediante microscopía de campo brillante. Las líneas celulares como las líneas celulares de cáncer de glioma forman esferoides en la parte inferior del pozo dentro de las 24 horas. Incubar los esferoides durante otras 48 horas para permitir la formación de una arquitectura celular 3D.
En el tercer día, coloque el colágeno, el medio de cultivo 5X, el hidróxido de sodio de un molar y un tubo de 20 mililitros sobre hielo. Añadir con cuidado y lentamente 10,4 mililitros de colágeno frío en el tubo de cultivo refrigerado. Evita las burbujas.
A continuación, agregue suavemente 1,52 mililitros de medio de cultivo 5X estéril en frío. Evita las burbujas. Justo antes de su uso, agregue suavemente 72 microlitros de hidróxido de sodio un molar estéril en frío y mantenga la solución en hielo.
Mezclar suavemente pipeteando y evitando burbujas. La mezcla eficiente conduce a un cambio de color de rojo a rojo anaranjado en el medio. Deje la mezcla sobre hielo hasta su uso.
A continuación, para quitar 190 microlitros de sobrenadantes de la placa de 96 pozos preparada en el primer día, utilice una pipeta en un ángulo hacia el lado del pozo. Tenga mucho cuidado de no molestar a los esferoides que se formaron en la parte inferior del pozo. Añadir suavemente 100 microlitros de la mezcla de colágeno a cada pozo, pipeteando por el lado del pozo.
Evite las burbujas y cualquier alteración del esferoide. Mantenga cualquier mezcla de colágeno restante en el tubo de 20 mililitros a temperatura ambiente para evaluar la polimerización. Incubar la placa en la incubadora durante al menos 10 minutos para permitir que el colágeno se polimerice.
Cuando el colágeno sobrante se vuelve semisólido y similar a una esponja, los esferoides están listos para ser tratados con inhibidor. Añadir los inhibidores a una concentración de 2X a cinco mililitros de medio de cultivo. Pipetear 100 microlitros del medio suavemente por el lado de cada pozo para evitar la alteración del esferoide.
Observe e imagine cada esferoide mediante microscopía de campo brillante en momentos de hora cero, 24 horas, 48 horas y 72 horas para evaluar la actividad del fármaco. Luego, devuelva la placa a la incubadora. Ahora, coloque la placa en una capucha de cultivo de tejido, y reemplace suavemente el sobrenadante con 100 microlitros de 1X PBS.
Tenga cuidado de no molestar el esferoide, y evite tocar el colágeno. Repita este paso de lavado tres veces más. Retire el lavado final en cada pozo y sustitúyalo con 100 microlitros de 4% de formaldehído en 1X PBS.
Coloque la placa de 96 pozos en un banco de laboratorio, cubra con papel de aluminio y déjelo durante 24 horas a temperatura ambiente. Al día siguiente, retire cuidadosamente el formaldehído y sustitúyalo con 1X PBS. Repita este lavado tres veces más.
A continuación, sustituya el lavado 1X PBS por 100 microlitros de solución Triton X-100 recién preparada. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Mientras tanto, prepare la solución de bloqueo con 50 mililitros de 1X PBS y 05% leche desnatada en polvo en un tubo de 50 mililitros, y mezcle bien.
Después de 30 minutos, retire el Triton X-100 y lávelo tres veces con 1X PBS. Añadir 100 microlitros de la solución de bloqueo a cada pozo e incubar durante 15 minutos. A continuación, diluir el anticuerpo acetilado IgG de ratón en el tampón de bloqueo en una proporción de uno a 100.
Centrifugar la mezcla tampón de bloqueo de anticuerpos primario durante cinco minutos a 15, 682 veces g. Retire cuidadosamente la solución de bloqueo en cada pozo y agregue de 25 a 50 microlitros del sobrenadante tampón de bloqueo de anticuerpos del tubo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora.
A continuación, retire la solución de anticuerpos de cada pozo y lave tres veces con 100 microlitros de 1X PBS. Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo a la concentración recomendada, además de cualquier mancha fluorescente adicional. Una vez más, centrifugar la solución secundaria de anticuerpos durante cinco minutos a 15, 682 veces g.
Retire la solución de bloqueo de cada pozo y agregue de 25 a 50 microlitros del sobrenadante secundario de anticuerpos. Incubar en la oscuridad durante 1 hora y media a temperatura ambiente. Retire la solución secundaria de tinte de anticuerpos y lave tres veces con 1X PBS, 100 microlitros por pozo.
Levante cuidadosamente los tapones individuales de colágeno por succión con una pipeta de plástico de 200 microlitros en el centro de un portaobjetos de vidrio. Agregue una gota de un montura adecuado para cubrir el enchufe de colágeno. Coloque un cubreobjetos en la parte superior de la muestra y guárdelo a temperatura ambiente en la oscuridad.
La tecnología de esferoides tridimensionales está avanzando en la comprensión de las interacciones fármaco-tumor porque es más representativa del entorno específico del cáncer. En este estudio, se detectaron posibles efectos anti-o pro-migratorios. Esto es especialmente notable en KNS42 con aparentemente ninguna migración en el control o esferoides tratados.
Se observó muerte celular en la concentración de inhibidores más alta de 10 micromolares. La fragmentación nuclear y las células migratorias eran evidentes en las células U251. Los esferoides celulares U251 tenían picos que se irradian lejos del esferoide original, con un aumento del redondeo celular en las células aparente con el aumento de la concentración de inhibidores.
Se observaron microtúbulos colapsados y fragmentación nuclear en KNS42. Las protuberancias con forma de hoja con picos de una sola célula indican la migración de KNS42. Con la concentración más baja de inhibidores, este fenotipo se pronunció, pero se perdió con el aumento de la concentración de inhibidores.
Es crucial dejar todos los reactivos sobre hielo hasta que estén listos. De lo contrario, el colágeno comienza a polimerizarse antes de que todo se haya añadido a los esferoides. Hay margen para cuantificar las imágenes generadas por la microscopía confocal para evaluar los efectos de, por ejemplo, fármacos migrastáticos en la morfología celular.
Nos permitió, por primera vez, confirmar el efecto del inhibidor migratorio MI-192 en los niveles de acetilado de microtúbulos y explorarlo más a fondo en términos de migración celular. Se debe tener especial cuidado al manipular el formaldehído para la etapa de fijación. Se aplican las pautas habituales de salud y seguridad.
