Dieses Protokoll ermöglicht die direkte Abgabe von Therapeutika in das zentrale Nervensystem der Ratte, um die Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Wirksamkeit neuartiger Therapeutika in Rattenkrankheitsmodellen zu bewerten. Dieses Verfahren ist sicher, effektiv und erfordert keine teuren Geräte oder chirurgischen Werkzeuge. Demonstriert wird das Verfahren von Yi Chen und Yi Luo, Forschern aus meinem Labor.
Um die speziellen Führungskanülen vorzubereiten, verwenden Sie ein Drehwerkzeug mit einem abgeschnittenen Rad, um beide Enden einer 19-Spur-Nadel abzuschneiden, um eine etwa eineinhalb bis zwei Zentimeter lange Führungskanüle zu erhalten. Dann verwenden Sie die Schleifscheibe des Drehwerkzeugs, um beide Enden zu glätten. Zur Vorbereitung der Katheterdrahtanordnung schneiden Sie ein acht Zentimeter langes Stück PE10-Schläuche mit einem Durchmesser von 011 Zoll als intrathekalen Katheter für jedes Tier.
Verwenden Sie einen ethanolresistenten Markerstift, um eine Markierung zwei Zentimeter von einem Ende jedes Schlauchstücks zu machen. Legen Sie für jedes Tier einen 11 Zentimeter langen, aus Polytetrafluorethylen beschichteten Edelstahldraht in das Lumen des acht Zentimeter großen PE10-Katheters ein. Zur Vorbereitung der Lieferkatheterbaugruppe ein Stück von fünf bis 10 Zentimetern PE50-Katheter mit einem Durchmesser von 023 Zoll schneiden und einen 23-Spur-Schlauchadapter in ein Ende des Katheters stecken.
Legen Sie dann eine 30-Spur-Nadel mit abgeschnittener Nabe in ein etwa 0,5 Zentimeter großes Stück PE10-Schläuche ein und verbinden Sie den PE10-Schlauch mit dem anderen Ende des Katheters. Um eine Führungskanülennadel-Montage vorzubereiten, legen Sie eine Führungskanüle über das Ende einer 23-Spur-Nadel. Bevor Sie mit der Operation beginnen, legen Sie ein Heizkissen auf den Operationstisch und bedecken Sie das Pad mit einem sterilen Drapat.
Legen Sie ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr auf das Blatt und bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in der anästhesierten experimentellen Ratte. Nach dem Wiegen des Tieres den Rücken vom Schwanz bis zur kaudalen Brustwirbelsäule rasieren und die rasierte Ratte auf das sterile Blatt in der anfälligen Position legen. Positionieren Sie das 50ml-Rohr unter dem Bauch, um die Wirbelsäule im Lendenbereich zu biegen, und tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf die Augen auf.
Als nächstes, subkutan injizieren ein Milligramm pro Kilogramm anhaltende Freisetzung Buprenorphin und reinigen Sie die exponierte Haut mit sequentiellen Povidon und Alkohol Peelings. Das Tier mit einem sterilen transparenten Blatt verdornen. Für die Platzierung des Katheters und die Injektion der Verbindung, identifizieren Sie die beiden natürlichen Gruben zwischen den Muskeln über dem rasierten Becken, und mit einer Hand, die die Gruben hält, verwenden Sie die andere Hand, um sanft zu drücken und fühlen Sie die Wirbelsäule von der kaudalen zur rostralen Richtung, um den ersten großen Einzug zwischen den Wirbeln zu lokalisieren.
Nach der Identifizierung des Intervertebral-Raums zwischen den Wirbeln S1 und L6, bewegen Sie sich leicht rostral, um den Intervertebral-Raum zwischen den Wirbeln L5 und L6 zu identifizieren. Verwenden Sie ein Skalpell, um einen nicht mehr als zwei Zentimeter langen Schnitt in Haut und Muskelkapsel an dieser Stelle entlang der Mittellinie von der rostralen bis kaudalen Richtung zu machen, so dass die Injektionsstelle in der Mitte des Einschnitts sein wird. Verwenden Sie eine Sezierschere, um das Bindegewebe zu sezieren, bis die Muskelschicht visualisiert werden kann.
Machen Sie einen ein Zentimeter Schnitt in der Muskelkapsel sofort seitlich zum dorsalen Wirbelsäulenprozess des L6 Lendenwirbels. Positionieren Sie die Führungskanülennadelinin in der Nähe des vorderen Aspekts des sechsten Lendenwirbels und schieben Sie die Baugruppe entlang des vorderen Aspekts des sechsten Wirbels in den Intervertebralen Raum, so dass das Ende der Nadel in den Spinalkanal eindringt. Verwenden Sie stumpfe Zangen, um den dorsalen Wirbelsäulenprozess des L6-Lendenwirbels zu lokalisieren und dann die Nadel entlang des vorderen Aspekts des sechsten Wirbels in den wirbellosen Raum zu schieben.
Drücken Sie die Führungskanüle entlang der Nadel, entfernen Sie die Nadel und legen Sie die Katheterdrahtbaugruppe in die Führungskanüle ein. Wenn Sie den Katheter in einem etwa 45-Grad-Winkel zum Spinalkanal anwinkeln, zwingen Sie das Ende des Katheters etwa 0,3 Zentimeter in den Kanal. Entfernen Sie den Stylet-Draht etwa 2,5 Zentimeter von der intrathekalen Spitze des Katheters und leiten Sie den Katheter in den Spinalkanal, bis die zwei Zentimeter markierte Markierung am Katheter nur unterhalb des Muskels sichtbar ist.
Wenn der Katheter vorhanden ist, entfernen Sie die Führungskanüle, um den Katheter und den Stylet-Draht an Ort und Stelle zu lassen. Fördern Sie den Katheter in den Spinalkanal, bis sich die Zwei-Zentimeter-Marke am Eingang des Kanals befindet, und ziehen Sie den Stylet-Draht vollständig zurück. Zerebrale Rückenmarksflüssigkeit kann beim Eindringen in den implantierten Katheter visualisiert werden.
Dann verbinden Sie die Entbindungskatheterbaugruppe über das 30-Spur-Nadelende an das distale Ende des implantierten Katheters. Als nächstes 60 Mikroliter steriler Saline in eine 100-Mikroliter-Spritze laden und einen Bolus von 30 Mikrolitern der Prüfverbindung in eine zweite Spritze laden. Schließen Sie die Salinespritze an das Rohradapterende der Förderkatheterbaugruppe an und spülen Sie 20 Mikroliter steriler Saline in den intrathekalen Raum.
Wenn die gesamte Saline gespült wurde, ersetzen Sie die Salinespritze durch die Bolus-Spritze und injizieren Sie 30 Mikroliter der Testverbindung über einen Zeitraum von 30 Sekunden in den intrathekalen Raum. Wenn der gesamte Bolus geliefert ist, ersetzen Sie die Bolus-beladungsspritze durch eine weitere mit Einer Sättigung beladene Spritze und spülen Sie den Katheter mit zusätzlichen 40 Mikroliter naline. Wenn das zweite Volumen der Kochsaline geliefert wurde, lösen Sie die Entbindungskatheterbaugruppe vom implantierten Katheter und verwenden Sie ein Paar sehr heißer wärmesterilisierter Sezierzangen, um die Schläuche zu klemmen, um den implantierten Katheter aseptisch zu schneiden und abzudichten.
Verwenden Sie resorbierbare Monofilament-Nähte, um den wärmeversiegelten Katheter am Bindegewebe zu befestigen und dann nicht resorbierbare Nähte zu verwenden, um die Haut zu schließen. Dann verwenden Sie Gaze und Saline, um Blut von der Haut zu waschen und legen Sie die Ratte in einem beheizten Inkubator mit Überwachung bis zur vollen Wiederverfrorenheit. In diesem repräsentativen Experiment wurde in allen Regionen, die nach der Einzigen Bolus-Antisense-Oligonukleotid-Abgabe gesammelt wurden, ein sehr guter Knockdown erzielt, wie gezeigt.
Allerdings wurde ein gewisses Maß an regionaler Variabilität gemessen, wobei das Rückenmark den höchsten Prozentsatz an Knockdown aufweist. Nach einer erfolgreichen Injektion des Antisense-Oligonukleotids oder anderer Therapeutika in ein geeignetes Modell kann man die Pharmakokinetik, Pharmakodynamik und Wirksamkeit der Therapeutika bewerten.
