Questo protocollo consente la somministrazione diretta di terapie nel sistema nervoso centrale del ratto per valutare la farmacocinetica, la farmacodinamica e l'efficacia di nuove terapie nei modelli di malattia del ratto. Questa procedura è sicura, efficace e non richiede attrezzature costose o strumenti chirurgici. A dimostrare la procedura saranno Yi Chen e Yi Luo, ricercatori del mio laboratorio.
Per preparare le speciali cannule guida, utilizzare uno strumento rotante con una ruota tagliata per tagliare entrambe le estremità di un ago calibro 19 per ottenere una cannula guida lunga circa uno e mezzo o due centimetri. Quindi utilizzare la mola dell'utensile rotante per levigare entrambe le estremità. Per preparare l'assemblaggio del filo del catetere, tagliare un pezzo lungo otto centimetri di tubi PE10 di 011 pollici di diametro per fungere da catetere intratecale per ogni animale.
Utilizzare una penna marcatore resistente all'etanolo per ottenere un segno a due centimetri da un'estremità di ogni pezzo di tubo. Per ogni animale, inserire un filo di stylet lungo 11 centimetri tagliato dal filo di acciaio inossidabile rivestito in politetrafluoroetilene nel lume del catetere PE10 di otto centimetri. Per preparare l'assemblaggio del catetere di consegna, tagliare un pezzo di catetere PE50 da cinque a 10 centimetri di diametro 023 pollici e inserire un adattatore tubo di 23 calibri in un'estremità del catetere.
Quindi inserire un ago calibro 30 con un mozzo tagliato in un pezzo di tubi PE10 di circa 0,5 centimetri e collegare il tubo PE10 all'altra estremità del catetere. Per preparare un assemblaggio di cannula-ago guida, posizionare una cannula guida all'estremità di un ago calibro 23. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, posizionare una pastiglia riscaldante sul tavolo dell'intervento chirurgico e coprire il pad con un foglio di drappo sterile.
Posizionare un tubo di centrifuga conica da 50 ml sul foglio e confermare la mancanza di risposta al pizzico nel ratto sperimentale anestetizzato. Dopo aver pesato l'animale, radere la schiena dalla coda alla colonna vertebrale toracica caudale e posizionare il ratto rasato sul foglio sterile in posizione prona. Posizionare il tubo da 50 ml sotto l'addome per flettere la colonna vertebrale nella regione lombare e applicare un unguento oftalmico agli occhi.
Successivamente, iniettare per via sottocutanea un milligrammo per chilogrammo di buprenorfina a rilascio prolungato e pulire la pelle esposta con povidone sequenziale e scrub alcool. Drappeggiare l'animale con un foglio trasparente sterile fenestrato. Per il posizionamento del catetere e l'iniezione del composto, identificare le due fosse naturali tra i muscoli sopra il bacino rasato e, con una mano che tiene le fosse, utilizzare l'altra mano per premere delicatamente e sentire la colonna vertebrale dalla direzione caudale a quella rostrale per individuare la prima indentazione principale tra le vertebre.
Dopo aver identificato lo spazio intervertebrale tra le vertebre S1 e L6, muoversi leggermente rostralmente per identificare lo spazio intervertebrale tra le vertebre L5 e L6. Usa un bisturi per fare un'incisione lunga non più di due centimetri nella pelle e nella capsula muscolare in questo sito lungo la linea mediana dalla direzione rostrale a quella caudale in modo che il sito di iniezione sia al centro dell'incisione. Utilizzare le forbici di dissezione per sezionare il tessuto connettivo fino a quando lo strato muscolare non può essere visualizzato.
Fare un'incisione di un centimetro nella capsula muscolare immediatamente laterale al processo spinale dorsale della vertebra lombare L6. Posizionare l'assemblaggio dell'ago della cannula guida vicino all'aspetto anteriore della sesta vertebra lombare e spingere l'assemblaggio nello spazio intervertebrale lungo l'aspetto anteriore della sesta vertebra in modo che l'estremità dell'ago penetri nel canale spinale. Utilizzare pini smussati per localizzare il processo spinale dorsale della vertebra lombare L6, quindi spingere l'ago lungo l'aspetto anteriore della sesta vertebra nello spazio invertebrata.
Spingere la cannula guida in posizione lungo l'ago, rimuovere l'ago e inserire l'assemblaggio del filo del catetere nella cannula guida. Inclinando il catetere con un angolo di circa 45 gradi rispetto al canale spinale, forzare l'estremità del catetere di circa 0,3 centimetri nel canale. Rimuovere il filo di stile a circa 2,5 centimetri dalla punta intratecale del catetere e far avanzare il catetere nel canale spinale fino a quando la marcatura dei due centimetri sul catetere è appena visibile sotto il muscolo.
Quando il catetere è in posizione, rimuovere la cannula guida per lasciare il catetere e il filo di stile in posizione. Far avanzare il catetere nel canale spinale fino a quando il segno dei due centimetri è all'ingresso del canale e ritirare completamente il filo di stile. Il fluido spinale cerebrale può essere visualizzato entrando nel catetere impiantato.
Quindi collegare il gruppo del catetere di erogazione all'estremità distale del catetere impiantato tramite l'estremità dell'ago calibro 30. Successivamente, caricare 60 microlitri di soluzione salina sterile in una siringa da 100 microlitri e caricare un bolo di 30 microlitri del composto in esame in una seconda siringa. Collegare la siringa salina all'estremità dell'adattatore di tubazione dell'assieme del catetere di erogazione e sciacquare 20 microlitri di soluzione salina sterile nello spazio intratecale.
Una volta che tutta la salina è stata lavata, sostituire la siringa salina con la siringa caricata con bolo e iniettare 30 microlitri del composto in esame nello spazio intratecale per un periodo di 30 secondi. Una volta che tutto il bolo è stato consegnato, sostituire la siringa caricata di bolo con un'altra siringa caricata salina e sciacquare il catetere con altri 40 microlitri di soluzione salina. Una volta consegnato il secondo volume di soluzione salina, staccare il gruppo del catetere di erogazione dal catetere impiantato e utilizzare un paio di pinze di dissezione sterilizzate termicamente molto calde per bloccare il tubo per tagliare e sigillare termicamente il catetere impiantato.
Utilizzare suture monofilamento assorbibili per fissare il catetere termo-sigillato al tessuto connettivo e quindi utilizzare suture non assorbibili per chiudere la pelle. Quindi utilizzare garza e soluzione salina per lavare il sangue dalla pelle e posizionare il topo in un'incubatrice riscaldata con monitoraggio fino alla piena ricompitenza. In questo esperimento rappresentativo, un'ottima abbattimento è stata ottenuta in tutte le regioni raccolte dopo la consegna di oligonucleotide antisense singolo bolo come dimostrato.
Tuttavia, è stato misurato un certo grado di variabilità regionale con il midollo spinale che presenta la più alta percentuale di abbattimento. Dopo un'iniezione riuscita dell'oligonucleotide antisense, o altre terapie, in un modello appropriato, si possono valutare la farmacocinetica, la farmacodinamica e l'efficacia delle terapie.
