Disociar con éxito pequeñas cantidades de tejido neural puede equipar a los laboratorios para obtener información específica de la estructura sobre la eficacia del tratamiento, la función celular, así como la enfermedad y los mecanismos de acción del tratamiento. Este protocolo de disociación neuronal produce consistentemente una suspensión unicelular altamente viable y real. Además, podemos procesar muestras que son solo una fracción de las que están destinados los kits comerciales.
La planificación y preparación adecuadas son clave para un resultado exitoso de esta técnica. Ejecutar varias rondas de práctica para familiarizarse con el protocolo sería beneficioso. Después de anestesiar a un ratón C57BL/6J hembra de seis meses de edad, pellizque la parte inferior del abdomen y levante la piel con fórceps.
Luego, con tijeras, corte a través del pelaje y la piel hasta la parte inferior de la caja torácica. Haga dos incisiones diagonales que comiencen por debajo de la caja torácica y se muevan hacia cada hombro. Luego reseque cuidadosamente el diafragma y la caja torácica para exponer el corazón.
Después de extraer cuidadosamente cualquier tejido conectivo alrededor del corazón, use tijeras para cortar la aurícula derecha. Luego apague el flujo de isoflurano hacia el respirador. Manteniendo el corazón firme con fórceps y con el bisel de la aguja de mariposa hacia arriba, perfore el ventrículo izquierdo mientras mantiene la aguja nivelada y paralela al animal.
A continuación, mantenga la aguja en su lugar, encienda la bomba y perfunda al menos 30 mililitros de la solución salina o heparina hasta que el líquido que sale del corazón sea opaco y el hígado y los pulmones de color pálido. Después de la perfusión, apague la bomba, retire la aguja y transfiera el ratón al área de disección. Después de la decapitación, corte el pelaje desde la parte posterior de la cabeza hasta los ojos y despegue la piel hacia atrás para exponer el cráneo.
A continuación, recorte el cráneo entre los ojos y haga dos cortes en la parte posterior del cráneo en las posiciones de las 10 y 2 en punto. Luego haga un corte largo a lo largo de la línea media sagital del cráneo hasta el corte original entre los ojos. A continuación, con fórceps, despegue las dos mitades del cráneo hacia los lados.
Luego use una espátula para extraer el cerebro y colóquelo en una placa de Petri de vidrio de 60 milímetros llena de DPBS frío y mantenida en hielo. Usando un bisturí o una maquinilla de afeitar, separe cada hemisferio y retire los bulbos olfativos y el cerebelo. Luego retire el mesencéfalo hasta que el hipocampo esté expuesto.
A continuación, asegure el cerebro con fórceps. Luego, usando un segundo juego de fórceps, saque suavemente el hipocampo de cada hemisferio. Transfiera ambos hipocampos a un tubo etiquetado de 1,5 mililitros que contenga DPBS frío y coloque el tubo sobre hielo.
Usando fórceps, transfiera las piezas de tejido del hipocampo a un tubo C y agregue 30 microlitros de mezcla de enzimas 2 en el tubo. Después de girar la tapa y apretar hasta que haga clic, coloque el tubo en un disociador y ejecute el programa apropiado. Mientras el programa se está ejecutando, moje previamente un colador de células de 70 micras colocado en un tubo cónico de 50 mililitros con dos mililitros de tampón BSA.
Una vez que se complete el programa de disociación, agregue cuatro mililitros de tampón BSA al tejido disociado y filtre la mezcla a través del colador celular en el tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, agregue 10 mililitros de DPBS al tubo C. Luego cierre el tubo, gire la solución suavemente y filtre a través del colador celular en el tubo cónico de 50 mililitros.
Centrifugar la suspensión de la célula filtrada, desechar el sobrenadante sin molestar el pellet y almacenar el pellet. Para la eliminación de escombros, vuelva a suspender el pellet con 1, 550 microlitros de DPBS frío y transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros etiquetado. Luego agregue 450 microlitros de solución de eliminación de escombros fríos y pipetee hacia arriba y hacia abajo.
Superponga suavemente la suspensión celular con un mililitro de DPBS frío, manteniendo la punta contra la pared del tubo cónico. Repita el procedimiento hasta que la superposición total sea de dos mililitros. A continuación, centrífuga la suspensión a 3.000 veces G durante 10 minutos con aceleración completa y descanso completo.
Aspire la capa superior, luego barre la punta de la pipeta hacia adelante y hacia atrás para aspirar la capa media blanca. Retire la mayor cantidad posible de la capa intermedia sin perturbar la capa inferior. A continuación, agregue dos mililitros de DPBS frío y pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
Luego centrífuga la suspensión a 1, 000 veces G durante 10 minutos con aceleración completa y descanso completo. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un tampón BSA de mililitros. Después del conteo celular, centrifugue la suspensión celular restante y vuelva a suspender el pellet en 50 microlitros de tinción muerta viva diluida.
Luego transfiera la muestra a un tubo de flujo etiquetado e incube a temperatura ambiente durante 8 a 10 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, agregue 500 microlitros de tampón BSA y repita el paso de centrifugación. Luego deseche el sobrenadante, dejando una pequeña cantidad de tampón en el tubo.
La puerta primaria excluyó los escombros en los gráficos de dispersión hacia adelante frente a los gráficos de dispersión lateral y las células muertas se excluyeron posteriormente. La segunda puerta excluyó las células positivas para la proteína básica de mielina. Y de las células restantes, se crearon diagramas de densidad de células positivas para cada fluorocromo.
La frecuencia de cada población de células neuronales se calculó a partir de la tercera puerta. Las muestras procesadas con disociación mecánica manual y digestión enzimática produjeron una población sustancialmente menor de células de interés, mientras que tanto las muestras frescas como las fijas procesadas con disociación mecánica automatizada y digestión enzimática mostraron una población varias veces mayor de células de interés. Si bien los pasos de perfusión y eliminación de escombros pueden ser desafiantes inicialmente, mantener una mano suave y firme puede ayudar a garantizar el éxito.
