Name: breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation
Uploaded: 2018-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
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MG es apoyado por becas K08DK101608 y R03DK111473 de los institutos nacionales de salud, marzo de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, los niños Discovery Institute de Washington University de St. Louis los niños Hospital y el Departamento de Pediatría de la Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL es apoyado por R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital descubrimiento Institute de Washington University infantil de St. Louis los niños.

Todos los procedimientos animales en este estudio fueron aprobados por la Universidad de Washington en St. Louis institucional Animal cuidado uso Comité (protocolo 20160187) o atención Animal institucional de la Universidad de Pittsburgh y uso Comité (protocolo 14103918). Intestino fetal humano en menos de 24 semanas de gestación se obtuvo siguiendo las directrices de contratación de Universidad de Pittsburgh anatómica del tejido después de la aprobación de la Junta de revisión institucional (protocolo PRO14100537) de la Universidad de Pittsburgh salud Ciencias Banco de tejidos a través de un sistema de intermediario honesto. Anónima la leche materna o leche materna de donantes pasteurizada se obtuvo con una dispensa del consentimiento de la Universidad de Pittsburgh Junta de revisión institucional.
1. cripta aislamiento y establecimiento de Enteroids de ratones neonatales o intestino humano prematuro
<ol><li>Preparación de medios de comunicación Nota: Los medios de comunicación deben estar preparados en la campana el día antes de aislamiento de la cripta.<ol>
<li>Preparar medios de cultivo L 1,11. Comenzar con 1 L de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/L glucosa y L-glutamina y añadir suero bovino Fetal (FBS) (concentración final 10%), 11 mL insulina estéril penicilina-estreptomicina (concentración final 1%) y 1,1 mL (final de 110 mL concentración 0,1%).</li>
		<li>Preparar 500 mL de PBS-antibiótico una mezcla. Comenzar con 500 mL 1 x solución salina de Dulbecco tamponada con fosfato (DPBS) con 10% FBS y añadir 5 mL de gentamicina (concentración final 1%), 1 mL (concentración final 0,2%), la anfotericina B y 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentración final 1%).</li>
		<li>Prepare 30 mL Media de interrupción celular #1. Primero prepare 30 mL de medio de cultivo. Añadir 600 μl 0.5 M dihidratada del ácido (EDTA) (concentración final 10 mM), 300 μL (concentración final 1%) de gentamicina y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%).</li>
		<li>Prepare 30 mL Media de interrupción celular #2. Primero prepare 30 mL de medio de cultivo. Añadir 300 μL 0.5m EDTA (concentración final 5 mM), 300 μL (concentración final 1%) de gentamicina y 60 μL de anfotericina B (concentración final 0,2%).</li>
		<li>Preparar medios de cultivo 50 mL cripta sin factores de crecimiento. Medir 33,4 mL 1 x avanzado DMEM/F-12 y añadir 10 mL de SFB (concentración final 20%).<ol>
<li>Añadir 500 μl penicilina-estreptomicina (concentración final 1%), 500 μl (concentración final 1%), de L-glutamina 500 μl gentamicina (concentración final 1%), 100 μl (concentración final 0,2%), la anfotericina B 2,5 μL 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane ácido sulfónico (HEPES) (concentración final 0,05 mM), 500 μl 100 mM N-acetilcisteína (concentración final 1 mM), 500 μl 100 x N-2 suplemento 1 mL 50 x suplemento libre de suero (por ejemplo, B-27) menos vitamina A y 500 μL 1 mM 100 x Y-27632.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar medios de cultivo 1 mL cripta con factores de crecimiento. En primer lugar preparar 1 mL de la cripta los medios de cultivo sin la factores de crecimiento. Añadir 2,5 μl 40 μg/mL Wnt3a (concentración final 100 ng/mL), 1 μl 100 μg/mL Noggin (concentración final 100 ng/mL), 2 μl 250 μg/mL R-Spondin (concentración final de 500 ng/mL) y 0,5 μl 100 μg/mL EGF (concentración final 50 ng/mL).</li>
	</ol></li>
	<li>Aislamiento de la cripta
	<ol>
<li>Lugar solubilizado Extracto de membrana del sótano (véase Tabla de materiales) en el hielo se descongele antes de empezar. Nota: Mantenga la membrana del sótano en hielo o se polimerice.</li>
		<li>En cumplimiento del protocolo institucional cuidado Animal y el Comité de uso de ratones más de 14 días de edad, eutanasia ratones con dos métodos de eutanasia con el segundo siendo un procedimiento físico para asegurar la muerte. Nota: Para los ratones menos de 14 días de edad, degollación es el procedimiento estándar con unas tijeras.</li>
		<li>Usando tijeras y pinzas, haga una incisión vertical hacia abajo de la línea media del abdomen, a través de la piel y el peritoneo, para toda la longitud del abdomen. Suprimir el intestino desde el estómago al intestino ciego con tijeras y retire el mesenterio con fórceps. Nota: Dos semanas de edad machos y hembras C57BL/6J ratón cachorros, cada pesaje g 5.5-7, fueron utilizados para el aislamiento de la cripta. Cualquier edad o tamaño del ratón puede utilizarse para el aislamiento de la cripta.</li>
		<li>Para preparar el intestino recién cosechado para el aislamiento de la cripta, posición del intestino recto y corte el intestino longitudinalmente a lo largo de toda su longitud con unas tijeras. Nota: Ratón y el intestino humano pueden ser preparados del mismo modo.</li>
		<li>Limpiar heces de intestino agitando suavemente el intestino ida y vuelta en un plato de Petri llenas de mezcla de PBS-antibiótico con unas pinzas.</li>
		<li>Añadir 30 mL de células interrupción medios #1 en un tubo cónico de 50 mL. Corte el intestino en trozos de longitud 0.5 cm directamente en el tubo. Fijar el tubo en un cubo de hielo y agitar suavemente el vibrador a velocidad más baja durante 15 minutos.</li>
		<li>Mientras que los tejidos se encuentran en la coctelera, obtener placas de 24 o 48 bien para crecer criptas si las enteroids se van a utilizar para el aislamiento de proteínas, RNA y DNA. Uso cámara de pozo 8 diapositivas creciendo criptas si los enteroids se van a utilizar para todo Monte proyección de imagen confocal.</li>
		<li>En la campana, añadir 15 μl de la membrana basal a la parte inferior de cada pocillo de la placa de la pozo 24 o 48. Si utiliza diapositivas cámara, añadir 9 μl de membrana del sótano en la parte inferior de cada cámara. Nota: Ajustar el volumen de la membrana basal según el tamaño de la placa si es necesario.</li>
		<li>Se extendió rápidamente la membrana del sótano con la punta de la pipeta para que la membrana del sótano forma una capa delgada en la parte inferior del pozo. Coloque la placa a 37 ° C en incubadora durante 30 min permitir que la membrana del sótano polimerizar. Nota: Las criptas no se fije si la membrana del sótano no es una fina capa o membrana basal contiene burbujas de aire.</li>
		<li>Después de 15 min en un agitador, el tejido del filtro a través de un tamiz de 100 μm. Deseche el flujo a través.</li>
		<li>Añadir 30 mL celular alteración Media #2 a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Quitar tejido de filtro y agregar al tubo.</li>
		<li>Fijar el tubo en un cubo de hielo y agitar suavemente el vibrador a velocidad más baja durante 15 minutos.</li>
		<li>Después de 15 minutos en el agitador, filtro de tejido a través de un tamiz de 100 μm. Mantener el flujo a través de en este paso, en el caso de rendimiento es bajo en pasos posteriores. Nota: Todo flujo a través de los tubos deberá ser mantenida en hielo.</li>
		<li>Añadir 15 mL DMEM con 4,5 g/L glucosa y L-glutamina a un nuevo tubo cónico de 50 mL. Quitar tejido de filtro y agregar al tubo. Vigorosamente agite el tubo con la mano por 10 filtro s. a través de un tamiz de 100 μm y recoger el flujo a través. Repita hasta que el flujo a través de contiene no partículas.</li>
		<li>En la campana, filtrar el flujo a través del paso anterior en un nuevo tubo cónico de 50 mL con 70 μm tamices de tejido de ratón o 100 μm tamices de tejido humano. Nota: Tienen filtros adicionales en modo de espera y Vierta lentamente como filtros estorbarán con escombros.</li>
		<li>Centrifugar el tubo a 200 x g por 8 min a 4 ° C y lugar directamente en un cubo de hielo en la campana. Quite el sobrenadante con una pipeta sin perturbar el pellet. Resuspender el precipitado con la cantidad total de la cripta los medios de cultivo sin la factores de crecimiento. Nota: Las criptas enriquecidas son la capa de 'arena' de la pelotilla. Bien, cada uno requiere 250 μl del medio de cultivo sin factores crecimiento de cripta.</li>
	</ol></li>
	<li>Establecimiento de enteroids
	<ol>
<li>Placa de la mezcla de medios de comunicación de cripta directamente sobre la membrana basal.</li>
		<li>Compruebe las criptas con un microscopio para garantizar proceso de aislamiento fue exitoso. Nota: Las células y bolas de células deseadas. Aproximadamente 100 criptas individuales se platean por pozo.</li>
		<li>Incubar la placa a 37 ° C durante 3 horas permitir que las criptas que se adhieren a la membrana del sótano. Nota: La incubación es con la cripta medios de cultivo sin la factores de crecimiento.</li>
		<li>Lentamente retire los medios de comunicación y criptas exceso que no se pudieron adjuntar utilizando una pipeta P-200. Nota: No molestes a la membrana basal como las criptas adjuntadas pueden desplazarse.</li>
		<li>Lentamente Añadir 250 μl de cripta medios de cultivo con factores del crecimiento a cada pocillo. Nota: Para 24, placas de 48 pocillos o cámara se desliza, 250 μl del medio de cultivo con factores crecimiento de cripta es suficiente.</li>
		<li>Sustituir los medios de comunicación cada 2 días con nueva cripta medios de cultivo con factores de crecimiento para 5 días antes de los tratamientos para permitir el crecimiento y fijación óptima.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ratón recolección de leche materna
<ol><li>Separar una presa lactante C57BL/6J en 7-12 días después del parto de sus cachorros durante 6 h antes de la ordeña.</li>
	<li>Anestesiar la presa lactante con isoflurano a través de un cono de nariz y administrar una inyección subcutánea de la oxitocina en 0,15 UI/kg de peso corporal. Espere 3 minutos antes de intentar el procedimiento de ordeño.</li>
	<li>Limpiar los pezones con etanol al 70% antes del procedimiento de ordeño y dejar secar.</li>
	<li>Extraer leche de las tetas una a la vez utilizando un extractor humano eléctrico con tubo de silicona de tamaño para adaptarse a las tetas de ratón en un tubo de colección de 5 mL. Nota: Extractores de leche óptima tienen dos ajustes, uno para la velocidad y succión. Es mejor comenzar con la configuración más baja de cada uno y ambos aumente lentamente hasta que se extrae la leche. Idealmente, el rendimiento total será ~ 500 μL - 1 mL de leche de ratón por presa de lactante.</li>
	<li>Leche materna inmediatamente alícuotas y conservar a-80 ° C. Nota: Evite congelar/descongelar ciclos.</li>
	<li>Tratar de enteroids el día 5 con 50 μl/mL de leche de ratón por mL de medio de cultivo con factores de crecimiento de la cripta durante 24 h a 37 ° C.</li>
</ol>3. todo montaje coloración de Enteroids
<ol><li>
Preparación de los reactivos
	<ol>
<li>Preparación de 16 mL 1 x PBS por 8 pozos.</li>
		<li>Preparación de paraformaldehído al de 4% de 2 mL (PFA) de 1 x PBS por 8 pozos.</li>
		<li>Preparar 2 mL 0,1% Tritón X-100 en PBS 1 x por 8 pozos.</li>
		<li>Preparar 24 mL PBS Tween (SAFT es 0,1% Tween 20 en 1 x PBS) por 8 pozos.</li>
		<li>Preparar 2 mL 10% burro normal de suero (NDS) en 0.1% SAFT (10% NDS/SAFT) por 8 pozos.</li>
		<li>Preparar 4 mL 1% NDS en 0.1% SAFT (1% NDS/SAFT) por 8 pozos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Día 1 la coloración
	<ol>
<li>Aspire de tratamientos y lave enteroids con PBS. Añadir 250 μl 4% PFA por pozo. Coloque en el rotador para 1-2 h a 4 ° C. Quitar 4% PFA con pipeta.</li>
		<li>Lavar 4 veces con 250 μL/pocillo 1 x PBS. Coloque en el rotador durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Nota: Es posible almacenar la placa durante 1-2 días a 4 ° C si es necesario.</li>
		<li>Añadir 250 μL/pocillo 0,1% Tritón X-100. Incubar durante 1 h a RT. retirar 0,1% Tritón X-100 con pipeta.</li>
		<li>Lavar 4 veces con 250 μL/pocillo 1 x PBS. Colocar en el rotor durante 15 min a TA.</li>
		<li>Añadir 250 μL/pocillo 10% NDS/SAFT. Incubar durante 45 minutos en quitar RT. 10% NDS/SAFT con pipeta.</li>
		<li>Añadir 250 μL/pocillo primaria del anticuerpo, diluido 1/250 en 1% NDS/SAFT e incubar toda la noche a 4 ° C. Nota: La dilución óptima del anticuerpo varía según el fabricante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Día 2 la coloración
	<ol>
<li>Lavado al menos 5 veces 4-5 h con 250 μL/pocillo de SAFT. Coloque en el rotador a 4 º C entre cada lavado.</li>
		<li>Añadir 250 μl/pozo secundario anticuerpo, diluido 1/1.000 en 1% NDS/SAFT. Envolver la placa en hoja e incubar durante una noche a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Día 3 la coloración
	<ol>
<li>Añadir 250 μL/pocillo nuclear mancha 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 15 minutos. Nota: Mantenga la placa en la oscuridad.</li>
		<li>Lavar 6 veces con 250 μL/pocillo de SAFT. Coloque en el rotador durante 10 min a 4 º C entre cada lavado.</li>
		<li>Cubreobjetos de montaje en cámara Deslice con el montaje de los medios de comunicación.</li>
		<li>Tomar imágenes con una de 40 X microscopio confocal objetiva y hacer igualmente en un editor de gráficos de trama (véase Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteroviruses+infect+human+enteroids+and+induce+antiviral+signaling+in+a+cell+lineage-specific+manner.">Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).</li><li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids.">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada para revelar y sin conflictos de interés.

El epitelio intestinal se compone de muchos subtipos celulares que son responsables de proporcionar la defensa del huésped frente a patógenos, mantener la integridad de la barrera del intestino y pueden ser violados en la patogenia de varias enfermedades. Mientras que los modelos animales pueden recapitular algunas facetas de la enfermedad, el modelo ex vivo de enteroids derivadas del intestino de los ratones y los seres humanos proporciona una plataforma para probar efectos de varios tratamientos. La importancia del modelo enteroide permite a los investigadores de la cultura y diferenciar células madre intestinales en todos los subtipos celulares epiteliales de ingenuo o animales enfermos y seres humanos que no están disponibles con los métodos existentes. Este sistema modelo puede utilizarse para infecciones con patógenos humanos que no pueden ser fácilmente traducibles en el ratón, como enterovirus25 o norovirus26 entre otros. El modelo enteroide tiene varias ventajas y usos; sin embargo, debe tenerse cuidado para asegurar la consistencia en los reactivos que se utilizan para hacer los medios de comunicación y los factores de crecimiento exógenos específicos que se requieren para la supervivencia de enteroids.
Dentro del modelo enteroide, varios pasos son de vital importancia para asegurar el éxito en la producción de enteroids. Para minimizar el frío tiempo isquémica, tejido debe procesarse convenientemente. Enteroids se puede producir hasta 24 horas después de que el tejido se recoge si el tejido se coloca en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) a 4 ° C. Esto puede facilitar la opción de envío o transporte si es necesario. Para el establecimiento de enteroids, la membrana del sótano debe ser una capa delgada y plana en la parte inferior de cada pocillo de las criptas conectar y crecer. Si la membrana del sótano no es plana o tiene burbujas presentes, las criptas pueden no adherirse y quitarse cuando los medios de comunicación. Después de las enteroids se establecen, pueden ser pasados cada 7 días o congelados en nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo. Retiro y adición de medios de cultivo con factores de crecimiento de la cripta y la administración de cada tratamiento deben hacerse lentamente y en el borde de cada pozo para evitar molestar a los enteroids. Interrupción de la enteroids puede hacer que se convierten en separado y arrastrados cuando los medios de comunicación. Para mejores resultados, se debe tener cuidado para preservar la integridad de la membrana basal y el enteroids Unido.
En el actual estudio, Divulgamos que enteroids derivadas de ratones neonatales y recién nacidos prematuros pueden crecer y proliferar en presencia de diferentes tipos de leche materna. Estos estudios avanzan nuestra comprensión de los efectos de la leche materna en el intestino prematuro. Ofrecemos un método detallado sobre cómo establecer culturas enteroide en el laboratorio de seres humanos y ratones. Además, demostramos un método eficiente de recolección de leche materna de un ratón lactante utilizando una bomba de mama humano eléctrico modificado. Mostramos ratón, leche materna de donantes pasteurizada y humanos mejorar el crecimiento y la proliferación de enteroids de ratones y seres humanos. Además, nos muestran proliferación enteroide disminuida en presencia de ligando TLR4 LPS, que fue restablecido cuando ratón, humanos o donante de leche materna fue administrada a la enteroids. Aplicaciones futuras pueden incluir medicina personalizada precisión con pantallas de drogas de alto rendimiento en enteroids obtenidos de neonatos después de la resección intestinal para ver cómo ciertos medicamentos pueden afectar al niño particular. Tomados en conjunto, esperamos otros laboratorios potencial éxito en la utilización de estas técnicas en muchos reinos diferentes de enfermedades pediátricas del intestino, incluyendo NEC, donde hay una necesidad clínica urgente desarrollar nuevas estrategias terapéuticas.

La enterocolitis necrotizante (NEC) es la principal causa de muerte por enfermedades gastrointestinales en los niños prematuros, que afecta a casi 1 en 10 bebés nacidos antes de las 29 semanas de gestación1,2,3. La mitad de los niños con el progreso de NEC para la forma más severa, donde la supervivencia es sólo 10-30%4,5. En los Estados Unidos, un estimado 2 billones USD al año se gastan tratando a niños con NEC6,7, sin embargo, la tasa de supervivencia ni terapia ha cambiado en los últimos 30 años. La patogenia de la NEC se caracteriza por lesiones intestinales y alteración mucosa curación8,9,10,11, sin embargo, las vías de señalización que conduce a una exacerbación respuesta inflamatoria y los mecanismos para revertir la inflamación permanecen incompleto entendidos.
La administración de leche humana se ha encontrado que la estrategia solamente protección contra NEC para recién nacidos prematuros. Previamente hemos demostrado que la leche materna protege contra el desarrollo de NEC mediante la inhibición de lo receptores inmunes innatas peaje-como el receptor 4 (TLR4) en el epitelio intestinal vía receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) señalización vía11. La suplementación de la leche materna a un fórmula experimental de NEC atenúa la respuesta inflamatoria en NEC según lo demostrado por inhibición de la apoptosis del enterocyte y restauración de la proliferación del enterocyte en una manera que depende de crecimiento epidérmico factor (EGF) y EGFR11. En otro estudio, se demostró que el nitrato, otro componente de la leche materna, contribuye a su naturaleza protectora modulando la perfusión intestinal, en comparación con fórmula infantil, que carece de nitrato y puede contribuir a la mayor frecuencia de NEC en fórmula alimentó a niños de12,13. Otros compuestos presentes en la leche materna que han demostrado para estar implicado en la protección contra el NEC son oligosacáridos de leche humana, L-arginina, glutamina y lactoferrina14,15,16, 1718,de,19. Estos elementos beneficiosos de la leche materna revelan la necesidad de su uso en la prevención de ECN, pero también subrayan la importancia de estudiar los mecanismos de señalización de vías y efectos celulares implicados en cómo la leche materna es mediar la protección contra el NEC .
En orden para otro estudio las propiedades protectoras de la leche materna en un modelo murino de NEC, hemos desarrollado una técnica novedosa, fácil de usar por que ratón puede extraerse leche materna de una presa anestesia mediante un pecho humano eléctrico bomba11,12 . Esta estrategia de adquirir leche de ratón es ventajosa, no sólo porque los extractores de leche humana son fácilmente disponibles y eficaces en la adquisición de la leche materna, sino también porque este método permite el análisis de leche de mama específicos. Como resultado, pueden comparar los efectos de la leche materna de ratón con los de la leche materna humana expresada como pasteurizada leche humana de donante de un banco de leche en modelos específicos. Esta técnica permite el estudio de los componentes de la leche materna en relación con su contribución a la prevención de NEC. Otros investigadores han desarrollado métodos de extracción de leche materna, sin embargo, estas técnicas son manuales y requieren típicamente más de un laboratorio miembro20,21,22. Aquí se presenta una técnica fácil que puede ser utilizada mediante la modificación de un extractor de leche eléctrico humano para recoger la leche de un ratón. Esta técnica puede aplicarse también a otras especies.
Para interrogar adecuadamente las vías de señalización involucradas con NEC, modelo de los sistemas es necesarios para evaluar todos los tipos de células diferentes a ser afectados en el proceso de la enfermedad. Aquí, discutimos una tal sistema modelo - enteroids - y su establecimiento del intestino humano y ratón. Enteroids intestinales humanos (HIEs) proporcionan en particular promesa significativa, ya que ofrecen un modelo humano innovador, genéticamente diversas ex vivo para ayudar en el estudio de procesos fisiopatológicos que ocurren en el tracto gastrointestinal 23. Enteroids se han encontrado para ser cultivadas a largo plazo y puede ser congelados para su posterior uso23, y a diferencia de los organoides Intestinal humano (HIOs), cuyos cultivos se desarrollan de células madre pluripotentes inducible, enteroids son generados a partir de células madre dentro de las criptas intestinales aislados24. Enteroids requieren menos mantenimiento, puede ser infectado rápidamente25y fácilmente se puede establecer desde las criptas intestinales se diferencian más que HIOs23. Por lo tanto, HIEs ofrecen muchas ventajas sobre las técnicas existentes porque puede ser desarrollados para cada región propiedades compositivas y funcionales del epitelio gastrointestinal humano23. El uso de enteroids es una opción altamente efectiva cuando se necesita un modelo humano del intestino, con apego a las limitaciones de cada región y facilidad de uso. Aquí se demuestra la técnica de aislamiento y mantenimiento de enteroids intestinal pequeño derivado de la célula de vástago primario de ratones y humanos prematuros.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Humulin N (Insulin)</td><td>Eli Lilly And Company</td><td>0002-8315</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco&#039;s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco</td><td>15290-026</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>1x Advanced DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>50x B-27 Supplement Minus Vitamin A</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse Wnt3a Protein</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN</td><td></td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse R-Spondin 1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3474-RS</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish</td><td>Eppendorf</td><td>0030700112</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030722116</td><td></td></tr><tr><td>48-Well Cell Culture Plate</td><td>Eppendorf</td><td>0030723112</td><td></td></tr><tr><td>8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System</td><td>Thermo Scientific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Tube</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;M Sterile Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2</td><td>Invitrogen</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope Leica TCS SP8 X</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS6</td><td>Adobe Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>18 G 1.5 Inch Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Oxytocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O3251</td><td></td></tr><tr><td>Human Double Electric Breast Pump</td><td>Lansinoh</td><td>044677530163</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round Bottom Test Tube</td><td>Corning</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Stoppers</td><td>Frey Scientific</td><td>560761</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 Antibody</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Human Mki67 primer F: 5&#039;-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3&#039; R: 5&#039;-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3&#039;</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

breast milk enhances growth of enteroids: an ex vivo model of cell proliferation

Enteroids intestinales pequeño humanos se derivan de las criptas y cuando se cultiva en un nicho de células madre contienen todos los tipos de células epiteliales. La habilidad de establecer enteroide humanas ex vivo sistemas de cultivo son importantes Fisiopatología intestinal modelo y estudiar las respuestas celulares particulares involucrados. En los últimos años, enteroids de ratones y humanos son se cultiva, los e inclinada lejos para usarlos en varios laboratorios en todo el mundo. Esta plataforma enteroide puede utilizarse para probar los efectos de diversos tratamientos y medicamentos y qué efectos se ejercen sobre los diferentes tipos de células en el intestino. Aquí, un protocolo para el establecimiento de primaria enteroids intestinal pequeño derivados de células madre derivadas de ratones neonatales y proviene de intestino humano prematuro. Por otra parte, este sistema de cultivo enteroide fue utilizado para probar los efectos de la leche materna específica. Leche de ratón puede obtenerse eficientemente usando un extractor de leche humana modificada y leche de ratón expresa entonces puede ser utilizada para experimentos de investigación adicionales. Ahora nos demuestran los efectos de ratón expresado, humano, y leche materna de donante en el crecimiento y la proliferación de las enteroids derivadas de ratones neonatales o intestino humano prematuro.

Primero intentamos investigar ya sea leche materna o leche materna de donantes pasteurizada tuvo un efecto en pequeños enteroids intestinal. De hecho, la leche materna y leche materna de donante aumentan el crecimiento de ratón neonatal (figura 1A) y enteroids derivados humanos prematuros (figura 1B).
Puesto que la leche materna humana aumentó el crecimiento de pequeños enteroids intestinal, luego investigamos si leche materna tuvo un efecto sobre la proliferación de la enteroids humana. Demostramos que la leche materna aumenta la proliferación de enteroids humano prematuro en comparación con el control (figura 2A–B, Ki67, coloración roja). Lo importante, leche materna de donante humano aumentado enteroide proliferación comparado al control, pero en un grado ligeramente menor que sin pasteurizar la leche materna (figura 2B–C). Luego evalúa la expresión del mRNA de Ki67 en el prematuro enteroids humano y descubrió que el Ki67 se incrementó en enteroids tratados con leche materna o leche materna de donante en relación con el control (Figura 2D).
Luego Queríamos ver si estos efectos fueron específicos con respecto a la leche materna. Hemos desarrollado una forma de recoger la leche de mama de ratones lactantes utilizando un extractor de leche humana disponibles en el mercado modificados como referencias11,12. Representado es una anestesiado presa lactante sometidos a recolección de leche usando este aparato (figura 3). La siguiente serie de experimentos fue realizada en enteroids de ratón y se evaluaron los efectos de la proliferación de la leche materna extraída de ratón, humanos o donante de leche materna. Como se muestra en la figura 4, ratón, humano, y aumento de la proliferación en el ratón enteroids en comparación con el control (Figura 4A–D) de la leche materna de donantes pasteurizada. Proliferación en el enteroids de ratón fue disminuida en presencia del ligando de TLR4, lipopolisacárido (LPS), en comparación con el control (Figura 4A, E). Lo importante, ratón, humano o donantes mama leche todo restaurada enteroide proliferación en presencia de LPS según lo demostrado por el aumento de la tinción de Ki67 en comparación con LPS solo (figura 4F–H).
De nuestros experimentos, nos muestran que pequeños enteroids intestinales derivados de ratones neonatales e intestino fetal humano prematuro se puede mantener en cultivo. Además ofrecemos un método de recogida de leche materna novela que proporciona una manera eficiente para extraer leche de ratones, que pueden utilizarse para varios experimentos. Hemos descubierto que la leche materna extraída de seres humanos o ratones aumentó el tamaño, crecimiento y proliferación en ratón y humanos enteroids. Por otra parte, ratón, humano y donante de leche materna había restaurado la proliferación enteroide después de la exposición de LPS. Esto sugiere que la leche materna puede ejercer un efecto antiinflamatorio en el intestino de los ratones y los seres humanos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig1.jpg"> Figura 1. La leche materna y leche materna de donante aumentan el tamaño y crecimiento de ratón y la enteroids humana. Microfotografías de pequeño enteroids intestinal de ratones neonatales (p14) o intestino humano prematuro trataron con medios (Control), la leche materna o leche materna de donante (50 μl/mL) para la barra de tamaño de 24 h.: 1.000 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56921/56921fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de este figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig2.jpg"> Figura 2. La leche materna y leche materna de donante aumentan la proliferación de la enteroids humana. (A) micrografías confocales de prematuros enteroids humanos cultivados durante 5 días, tratar con la leche materna y leche materna de donantes pasteurizada durante 24 h y manchadas por el marcador de proliferación Ki67 (rojo) y DAPI (azul, nuclear). Barra de tamaño: 50 μm. (B) qRT-PCR para la expresión de Ki67 del enteroids humano en relación con el gen housekeeping RPLO. n = 5 por grupo. p < 0,0001 comparaciones con la prueba t de Student en comparación con el control. Los datos son medias ± desviación estándar. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56921/56921fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig3.jpg"> Figura 3. Colección de leche de un ratón anestesiado mediante una bomba de mama humano modificado. Tubos de bombas de mama humana estéril colocan en tetinas de anestesiados presa lactante después de recibir la inyección de oxitocina. Leche de ratón se recoge usando el extractor de leche humana en velocidad media y potencia en un tubo de colección de 5 mL. Volúmenes colectivos extraídos de toda gama de tetinas de 500 μl a 1 mL por ratón en postnatales días 7-12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56921/56921fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56921/56921fig4.jpg"> Figura 4. Ratón, humano, y mejorar la leche materna de donantes pasteurizada proliferación de ratón enteroide. (A-H) Micrografías confocales de p14 pequeño ratón intestinal enteroids (Control A) tratan con leche de ratón (MBM, B), la leche materna (BM, C), o leche materna de donante humano (DBM, D) en 50 μl/mL de media por 12 h en la ausencia ( A-D) o presencia de lipopolisacárido (LPS) en una dosis de 25 μg/mL de media por 12 h, (E-H) y manchada por el marcador de proliferación Ki67 (rojo) y DAPI (nuclear, azul). Barra de tamaño: 50 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56921/56921fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular

Este protocolo describe cómo establecer un sistema de cultivo enteroide de ratón neonatal o precoz del intestino humano así como un método eficiente para recoger la leche de ratones.

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

19.4K vistas.  Washington University School of Medicine. Este protocolo describe cómo establecer un sistema de cultivo enteroide de ratón neonatal o precoz del intestino humano así como un método eficiente para recoger la leche de ratones.

Video: Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Nutriente Reglamento mediante la alimentación continua de expansión a gran escala de células de mamífero en esferoides

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Investigación

Bioingeniería

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Investigación sobre el cáncer

Recapitulating Suckling-to-Weaning Transition In Vitro using Fetal Intestinal Organoids

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to digest solid food. This process is termed suckling-to-weaning transition and results in the replacement of neonatal epithelium with adult epithelium which goes hand in hand with metabolic and morphological adjustments. These complex developmental changes are the result of a genetic program that is intrinsic to the intestinal epithelial cells but can, to some extent, be modulated by extrinsic factors. Prolonged culture of mouse primary intestinal epithelial cells from late fetal period, recapitulates suckling-to-weaning transition in vitro. Here, we describe a detailed protocol for mouse fetal intestinal organoid culture best suited to model this process in vitro. We describe several useful assays designed to monitor the change of intestinal functions associated with suckling-to-weaning transition over time. Additionally, we include an example of an extrinsic factor that is capable to affect suckling-to-weaning transition in vivo, as a representation of modulating the timing of suckling-to-weaning transition in vitro. This in vitro approach can be used to study molecular mechanisms of the suckling-to-weaning transition as well as modulators of this process. Importantly, with respect to animal ethics in research, replacing in vivo models by this in vitro model contributes to refinement of animal experiments and possibly to a reduction in the use of animals to study gut maturation processes.

This protocol describes how to mimic suckling-to-weaning transition in vitro using mouse late fetal intestinal organoids cultured for 30 days.

Transición recapitulante de lechón a destete In Vitro usando organoides intestinales fetales

At the end of the suckling period, many mammalian species undergo major changes in the intestinal epithelium that are associated with the capability to ...

Biología del Desarrollo

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

Generación de organoides mamarios de mosaico por trippsinización diferencial

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

Medicina

Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves composed of a number of terminal duct lobular units made of secretory alveoli and converging ducts1. In mice, a similar architecture is observed at pregnancy in which ducts and alveoli are interspersed within the connective tissue stroma. The mouse mammary gland epithelium is a tree like system of ducts composed of two layers of cells, an inner layer of luminal cells surrounded by an outer layer of myoepithelial cells denoted by the confines of a basement membrane2. At birth, only a rudimental ductal tree is present, composed of a primary duct and 15-20 branches. Branch elongation and amplification start at the beginning of puberty, around 4 weeks old, under the influence of hormones3,4,5. At 10 weeks, most of the stroma is invaded by a complex system of ducts that will undergo cycles of branching and regression in each estrous cycle until pregnancy2. At the onset of pregnancy, a second phase of development begins, with the proliferation and differentiation of the epithelium to form grape-shaped milk secretory structures called alveoli6,7. Following parturition and throughout lactation, milk is produced by luminal secretory cells and stored within the lumen of alveoli. Oxytocin release, stimulated by a neural reflex induced by suckling of pups, induces synchronized contractions of the myoepithelial cells around the alveoli and along the ducts, allowing milk to be transported through the ducts to the nipple where it becomes available to the pups 8. Mammary gland development, differentiation and function are tightly orchestrated and require, not only interactions between the stroma and the epithelium, but also between myoepithelial and luminal cells within the epithelium9,10,11. Thereby, mutations in many genes implicated in these interactions may impair either ductal elongation during puberty or alveoli formation during early pregnancy, differentiation during late pregnancy and secretory activation leading to lactation12,13. In this article, we describe how to dissect mouse mammary glands and assess their development using whole mounts. We also demonstrate how to evaluate myoepithelial contractions and milk ejection using an ex-vivo oxytocin-based functional assay. The effect of a gene mutation on mammary gland development and function can thus be determined in situ by performing these two techniques in mutant and wild-type control mice.

This method describes how to dissect and assess mammary gland development and function from mice. Excised mammary glands are assessed for the degree of development using whole mount while milk ejection is evaluated using an oxytocin-based myoepithelial cell contraction assay.

Evaluación de la glándula mamaria de desarrollo y función en modelos de ratón

The human mammary gland is composed of 15-20 lobes that secrete milk into a branching duct system opening at the nipple. Those lobes are themselves ...

Biología

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue architecture. In current layer-by-layer extrusion bioprinting, individual cells are extruded in a bioink together with complex spatial and temporal cues to promote hierarchical tissue self-assembly. However, this biofabrication technique relies on complex interactions among cells, bioinks and biochemical and biophysical cues. Thus, self-assembly may take days or even weeks, may require specific bioinks, and may not always occur when there is more than one cell type involved. We therefore developed a technique to directly bioprint pre-formed 3D breast epithelial spheroids in a variety of bioinks. Bioprinted pre-formed 3D breast epithelial spheroids sustained their viability and polarized architecture after printing. We additionally printed the 3D spheroids onto vascular endothelial cell networks to create a co-culture model. Thus, the novel bioprinting technique rapidly creates a more physiologically relevant 3D human breast model at lower cost and with higher flexibility than traditional bioprinting techniques. This versatile bioprinting technique can be extrapolated to create 3D models of other tissues in additional bioinks.

The goal of this protocol is to directly bioprint breast epithelial cells as multicellular spheroids onto pre-formed endothelial networks to rapidly create 3D breast-endothelial co-culture models which can be used for drug screening studies.

Bioimpresión directa de esferoides multicelulares de mama 3D en redes endoteliales

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

In vitro Modelo enteroide apical de enterocolitis necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

Cuantificación de células proliferativas y muertas en enteroides

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...