La materia activa se ha utilizado en diversas aplicaciones como las sombras moleculares. Para llevar la aplicación al siguiente nivel, necesitamos desarrollar la capacidad de controlar la materia activa localmente. Proporcionamos un método fácil de usar que no requiere la modificación del fluido activo.
Tampoco la necesidad de modificar la trayectoria óptica del microscopio para lograr el control local del fluido activo. Nuestro método se puede aplicar a una amplia gama de sistemas donde las principales reacciones obedecen a la ley errónea, como el ensayo de deslizamiento de microtúbulos o los sistemas basados en enzimas. La configuración implica un sistema de circulación de agua.
Si se producen fugas, el agua puede dañar el microscopio. Por lo tanto, antes de adoptar nuestro protocolo, es importante asegurarse de que el sistema está libre de fugas. Nuestro protocolo requiere el montaje de la muestra de vidrio en una etapa de temperatura.
Mientras que el manuscrito describe el procedimiento de montaje, carece de sutilezas mecánicas como asegurar la muestra al escenario. Demostrando el procedimiento, serán Teagan Bate, Edward Jarvis y Megan Varney. Teagan y Edward son estudiantes de posgrado, y Megan es una estudiante de pregrado de un laboratorio.
Para preparar fluidos activos en un tubo Eppendorf, mezcle 16 microlitros de siete puntos de ocho miligramos por micróbulos mililitros con seis microlitros de seis puntos siete de un punto ocho cúmulos de motores de kinesina micromolar, y un punto uno microlitros de 500 milivolares TDT en M2B de alta sal. Agrupe los microtúbulos añadiendo 11 puntos cuatro microlitros de siete por ciento de peso en peso de polietilenglicol. A continuación, active los motores de kinesina añadiendo dos microlitros de ocho puntos de 50 ATP mililolares.
Mantener las concentraciones de ATP añadiendo dos microlitros de punto ocho de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa, y 13 puntos tres microlitros de 200 piruvato de fosfeno milimolar. Reduzca el efecto de blanqueo fotográfico añadiendo 10 microlitros de 20 trolox milimotores, un punto un microlitros de tres puntos cinco miligramos por mililitro catalasa, un punto un microlitros de 20 miligramos por mililitro de glucosa oxidasa, y un punto uno microlitros de 300 miligramos por mililitro de glucosa. Realice un seguimiento del movimiento del fluido añadiendo un punto seis microlitros de punto cero cero dos cinco por ciento de volumen por partículas trazadoras de volumen.
Añadir M2B de alta sal para lograr un volumen total de 100 microlitros. A continuación, enjuague un portaobjetos de vidrio recubierto de poliacrilamida y cubra el deslizamiento con agua DI. Seque los vasos con aire presurizado.
Coloque los vasos sobre una superficie limpia y plana. Corta un canal de tres milímetros de ancho en la película de cera. La anchura total es la misma anchura que el resbalón de la cubierta de vidrio a 20 milímetros.
Inserte la cera entre la diapositiva y el resbalón de la cubierta para formar un canal de celda de flujo para el fluido. Adherir el vidrio a la película de cera colocando el complejo de cera de vidrio en una placa caliente de 80 grados Celsius para derretir la cera. Durante el derretimiento, presione el resbalón de la cubierta suavemente con una punta de pipeta para adherir uniformemente la película de cera a las superficies de vidrio.
Después de la adhesión, enfríe el complejo de vidrio a temperatura ambiente. Cargue rápidamente los fluidos activos preparados en el canal de flujo con la punta de la pipeta en un ángulo alejado de la abertura del canal y en contacto con la superficie de la diapositiva de vidrio. Selle el canal con pegamento UV.
Después de construir una configuración de control de temperatura, coloque la muestra de fluido activa en la superficie del zafiro con el lado de la corredera en contacto con la superficie. Asegure la corredera de vidrio con cinta adhesiva. Con cinta de cobre, conecte el ThermoSensor a la superficie deslizante de la cubierta.
Para montar la configuración en una etapa del microscopio, con la corredera deslizante de la cubierta orientada hacia los objetivos, asegure la configuración con abrazaderas de aguja de la etapa del microscopio. Encienda el controlador de temperatura y la bomba de la pecera. Siga la guía del fabricante para establecer la temperatura objetivo.
Habilite el control de temperatura. Y registre los datos de temperatura de ThermoSensor. I imagen de la muestra con un intervalo de tiempo constante en una microscopía fluorescente equipada con un cubo de filtro GFP para monitorear las partículas trazadora etiquetadas Alexa 488 en la mezcla activa.
Ajuste el intervalo de tiempo para permitir que el desplazamiento del trazador entre fotogramas esté dentro de nueve píxeles. Para los trazadores de imágenes que se mueven a 10 micrómetros por segundo, utilizando un objetivo de cuatro veces, se recomienda que el intervalo de tiempo sea de uno a cinco segundos. Guarde las imágenes como archivos TIF, asigne un nombre a los archivos en función del número de fotograma y guárdelos en una carpeta independiente.
Para este líquido activo a base de microtúbulo accionado por kinesina, la temperatura se controló a 10, 20, 30 y 40 grados Centígrados. La fluctuación de la temperatura fue dentro del punto cero uno a cero punto tres grados Celsius durante cuatro horas demostrando la estabilidad y fiabilidad de esta configuración de control de temperatura. Los trazadores se visualizaban cada dos segundos, lo que las imágenes secuenciales permitían rastrear trayectorias de trazador.
Las velocidades medias medidas a 20 a 36 grados celsius, parecían ser casi independientes del tiempo en cero a dos horas. Donde a 10 y 40 grados Celsius, las velocidades medias se desintegraron rápidamente causadas por la despolimerización de microtúbulos por debajo de 16 grados Celsius y los racimos de kinesina fallan por encima de 36 grados Centígrados respectivamente. Cuando las temperaturas del sistema se alternaron entre 20 y 30 grados celsius cada 30 minutos, las velocidades medias de los fluidos activos no sólo aceleraron y desaceleraron en consecuencia, sino que también respondieron al cambio de temperatura en 10 segundos.
Los fluidos activos comienzan a funcionar mal, cuando se enfrían por debajo de 16 o se calientan por encima de 36 grados. Así que al manipular el controlador de temperatura, asegúrese de que la temperatura está entre 16 y 36 grados. La capacidad de ajustar el fluido activo localmente, permite dirigir la potencia del fluido, como entregar cargas desde el punto A al punto B o desarrollar un dispositivo de microfluididad que no requiere una válvula física.
La acrilamida utilizada para recubrir la cristalería es una neurotoxina que puede absorberse a través de la piel. Use el equipo de protección adecuado, como guantes, abrigos de laboratorio y gafas de seguridad, para minimizar el riesgo.
