Desarrollamos un método novedoso para registrar la señal neuronal extracelular del cerebro de los peces que nadan libremente. Esto abre la puerta al estudio de los mecanismos de la neurona al final del comportamiento de los peces del día. Este método es válido y a prueba de agua y por lo tanto permite la grabación mientras los peces nadan libremente en el tanque de agua.
Además, la ubicación de grabación se puede controlar mediante la microenlocución incorporada. Tal Zoor-Novoplansky, nuestro técnico de laboratorio, me ayudará a demostrar este procedimiento. Para construir la carcasa, utilice una placa de latón con dimensiones de 19 milímetros por 29 milímetros por un milímetro.
Con dos aberturas de 5,5 milímetros en los lados largos, perpendiculares al borde. Las hendiduras deben estar a 6,5 milímetros de distancia del lado estrecho. Usando alicates, dobla el área entre las hendiduras en los lados largos hacia adentro.
A continuación, doble la parte inferior hacia adentro y la parte superior hacia afuera para obtener la carcasa. A continuación, utilice una broca de eneldo de tres milímetros para hacer agujeros en la carcasa de microunidad para los tornillos y soldar los lados de la carcasa. Utilice un archivo circular fino para crear una pequeña ranura semicircular en la parte inferior de la carcasa que tiene un radio de 1,5 milímetros.
Usando una broca de un milímetro hacer un agujero en la parte posterior de la carcasa para los tetrodos. En primer lugar, utilice un cortador para romper una pieza de tres pines de una tira de cabezal de pasador macho de una sola fila. Usando alicates tire del pasador central.
A continuación, utilice una herramienta de corte para cortar los pasadores restantes a 10 milímetros de longitud. Utilice una broca número 65 para perforar un agujero a través del orificio del pasador central y utilice un doble cero 99 grifo para perforar una rosca. Montar la micro unidad y las placas de latón.
Inserte un tornillo a través de la primera placa de latón, a través de la rosca del cabezal del pasador y luego a través de la segunda placa de latón. Por último, coloque una tuerca en el tornillo y apriete suavemente el microconducción montado. Soldar los pasadores junto con las placas de latón y soldar la tuerca junto con la punta del tornillo.
Después de esto, soldar la micro unidad en la carcasa del micro drive en cuatro puntos en los lados de las placas de latón de micro-unidad. Usando pegamento epoxi un tubo de acero inoxidable de seis milímetros de largo a la pequeña abertura semicircular en la parte inferior de la carcasa del microencontro. Pegue un tubo de acero inoxidable de tres milímetros de largo en la cabeza del pasador para que esté alineado con el tubo de seis milímetros de largo en la carcasa.
Inserte los tubos de silicona y poliimida preparados en los dos tubos de acero inoxidable y utilice pegamento de cianoacrilato para pegarlos al tubo de robo inoxidable unido al cabezal del pasador. A continuación, atornillar la micro unidad hasta el final y cortar el exceso de tubo de la parte superior e inferior de los dos tubos de acero. A continuación, corte dos cables de plata desnudos con un diámetro de 75 micrómetros a una longitud de 12 centímetros y sueldelé tanto a la conexión a tierra en la placa de interfaz de electrodos como a todos los canales no utilizados.
Empuje uno de los cables de tungsteno preparados en uno de los orificios de una placa de interfaz de electrodo de 16 canales. Coloque un pasador en el agujero y presiónelo con un par de alicates. Mida la resistencia entre el pasador y el lado no codificado del cable para comprobar la conectividad.
Repita este proceso para todos los cables preparados, incluido un cable de 50 micrómetros para electrodo de referencia. A continuación, agrupe los cables de electrodos en dos grupos de cuatro cables cada uno y fírtelos usando cinta adhesiva al final de cada cable dejando el cable de referencia solo. Sujete la placa de interfaz del electrodo por encima de un dispositivo de torneado motorizado y coloque el extremo de la cinta de conducto de un grupo de cuatro cables en el dispositivo.
Aplicar 130 rondas en el sentido de las agujas del reloj seguidas de 20 rotaciones en sentido contrario a las agujas del reloj. A continuación, aplique pegamento de cianoacrilato para cubrir el tetrodo. Después de que el pegamento se haya curado, corte el tetrode cerca de la cinta adhesiva.
Repita este proceso de rotación, encolado y corte al otro tetrode. En primer lugar, conecte la carcasa de la microenlazada a la caja del registrador con dos tornillos de milímetros. Enrosque los tetrodos y el electrodo de referencia a través del orificio en la parte posterior de la carcasa del microconducción.
Enhebrar los tetrodos a través de los dos tubos de silicona y enhebrar el cable de tungsteno de 50 micrómetros a través del tubo de poliimida. Atornille el micro inmersión hasta el final y aplique pegamento de cianoacrilato a la parte superior de los tubos para pegar los tetrodos y cables a sus tubos y asegurar que el movimiento sea consistente con el microenlacio. Atornillar la micro unidad hasta la parte superior.
Aplique petróleo blando al tetrodo expuesto y a los cables dentro de la carcasa del microenlazo para evitar el movimiento. Coloque una ventana inferior de la placa de petri precortado en la parte delantera de la carcasa de la microenlace con epoxi mientras se asegura de mantener los cables de tierra fuera de la ventana. A continuación, aplique recubrimiento vulcanizante a temperatura ambiente a los tetrodos y cables expuestos entre la cubierta de la caja del registrador y la carcasa de la micromotora.
Utilice tijeras afiladas para cortar los tetrodos y el alambre de referencia a la longitud deseada. Después de esto, adjunte la espuma de poliestireno marcada y exudada a la caja. Ajuste su tamaño para que su flotabilidad esté equilibrada cuando se sumerja en el baño de agua.
Después de anestesiar el pescado, saque el pescado del agua y colóquelo en el soporte. Use una espátula estéril para aplicar una pasta de lidocaína del cinco por ciento en la piel por encima del sitio de la cirugía designada durante 10 minutos. Luego retire la lidocaína.
Utilice un bisturí de hoja tipo 15 estéril para extraer la piel por encima del cráneo en la región designada para el implante. Luego utilice un taladro dental con brocas de 0.7 milímetros para perforar cuatro agujeros en el cráneo. Aplique pegamento de cianoacrilato a uno de los orificios e inserte inmediatamente un tornillo de un milímetro.
Repita este proceso para los taladros restantes. Después de esto, utilice un quemedor dental para aplicar cemento dental en los tornillos y en la periferia del cráneo expuesto. Usando el taladro dental hacer un agujero que es de cinco milímetros de diámetro por encima de la región cerebral de interés.
Usa pinzas finas y papel de tejido blando para eliminar el tejido graso entre el cráneo y el cerebro y exponer el objetivo de la región cerebral teniendo cuidado de no dañar los vasos sanguíneos grandes debajo del cráneo. En primer lugar, baje el implante de tal manera que los electrodos se inserten en el cerebro mientras que la parte inferior de la carcasa del micro drive está cerca del cráneo. Comience a fijar el implante al cráneo aplicando una pequeña cantidad de cemento dental entre la carcasa y el tornillo del cráneo más cercano.
Después de que la primera parte del cemento dental se cura aplicar cemento dental de adición y cerrar el agujero por encima del cráneo y todo el cráneo expuesto. Después de lavar las branquias del pez con agua fresca para despertarlo, retire el pescado del soporte y colóquelo de nuevo en su tanque de origen. Asegúrese de que el pez es capaz de nadar libremente con el implante.
El objetivo de estos experimentos es estudiar cómo la actividad neuronal de las células individuales codifica el comportamiento del pez. Para lograr esto se implanta una matriz de tetrodos en el telencéfalo de peces dorados de natación libre que permite registrar la actividad neuronal. La actividad cerebral mientras se registra se digitaliza en 31, 250 Hertz y paso alto filtrado a 300 Hertz por el registrador de datos.
A continuación, sin conexión se aplica un filtro de paso de prohibición a las señales y los datos sin procesar preordenados se separan en el canal de cada tetrode y el canal de referencia. Los siguientes algoritmos comunes de clasificación de picos se utilizan para caracterizar la actividad de una sola celda. En primer lugar, cada canal se filtra manualmente por el umbral de amplitud de pico mínimo.
También se filtran los picos que aparecieron en más de un tetrode o en el canal de referencia. A continuación, los picos detectados se agrupan manualmente y se filtran por forma, longitud, intervalo de interpuntes y análisis de componentes de principio. Es importante comprobar la integridad del implante antes de la cirugía.
El tetrodo se puede comprobar utilizando un medidor de impedancia estándar y la caja debe ser revisada para detectar fugas bajo el agua. Este método se puede modificar para trabajar con muchos animales acuáticos, siempre y cuando sean lo suficientemente grandes como para sostener el sistema. Esto permite estudiar el mecanismo neural que subyacen a su comportamiento.
