Este protocolo paso a paso muestra cómo detectar y caracterizar funcionalmente la actividad enzimática de las ligasas de ubiquitina tipo RING E3, tanto in vitro como en planta, a través de un enfoque de mutagénesis dirigido por el sitio. Mediante la introducción de mutaciones en un dominio RING a través de la mutagénesis dirigida por el sitio, el mutante con deficiencia de E3 resultante se puede probar en paralelo con la proteína de tipo salvaje para vincular la actividad enzimática con la funcionalidad. Elucidar la base bioquímica y mecánica de las ligasas de ubiquitina tipo RING E3 puede contribuir en gran medida a nuestra comprensión de su importancia biológica en el desarrollo, la señalización del estrés y el mantenimiento de la homeostasis.
Con una ligera modificación del sistema de expresión in vivo, este protocolo se puede aplicar al análisis de cualquier ligasa de tipo RING E3 independientemente de su origen. Comience por identificar las Cys conservadas y Sus aminoácidos en el dominio RING y diseñar imprimaciones que lleven el codón de sustitución de interés flanqueado por 15 pares base a cada lado del sitio de la mutación. Es fundamental identificar adecuadamente el dominio RING, particularmente sus residuos de cisteína y histidina conservadas.
Las herramientas en línea como PROSITE se pueden utilizar para hacerlo. Utilice las imprimaciones mutagénicas en amplificación de PCR para introducir la mutación deseada en el plásmido que alberga el gen de interés, asegurándose de utilizar una polimerasa de ADN de alta fidelidad, como Pfu. Después de la PCR, digiere el ADN metilado y semimetilado parental derivado de E.coli mediante la adición de tres microlitros de la enzima de restricción Dpnl directamente a la reacción PCR y la incubación a 37 grados centígrados durante dos horas.
Purificar los plásmidos mutagenizados con un kit comercial de extracción de ADN, y eluir el ADN en 50 microlitros de agua. A continuación, transforme las células químicamente competentes DH5-alpha E.coli con 0,5 microlitros del ADN plásmido mutagenizado recuperado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Clonar los genes RING de tipo salvaje y RING mutados de interés en el vector pMAL-c2 para fusionar estos genes con la etiqueta de epítopo MBP.
A continuación, configure la reacción de ubiquitinación in vitro en un volumen total de 30 microlitros, como se describe en el manuscrito, e incubar la mezcla a 30 grados centígrados durante dos horas. Terminar la reacción mezclando la muestra con 7,5 microlitros de 5x tampón de carga SDS-PAGE y hirviendo durante cinco minutos, luego separar las proteínas con 7.5%SDS-poliacrilamida gel electroforesis. Pasar a la membrana PVDF, y detectar la ubiquitinación con hinchazón occidental y anti-FLAG.
Manche la membrana con Coomassie azul para verificar la carga igual de proteína de tipo MBP-RING probada. Rayar las cepas de Agrobacterium tumefaciens que llevan el gen con etiqueta de epítopo de interés en el medio LB que contiene los antibióticos de selección adecuados. Después de dos días de crecimiento a 28 grados centígrados, recoger colonias individuales, y cultivarlas en medio líquido LB con antibióticos a 28 grados Celsius y 250 rpm durante otras 24 horas.
Transfiera 100 microlitros de cultivo agrobacteriano a tres mililitros de LB fresco con antibióticos, e incubar el cultivo durante cuatro a seis horas adicionales. Gire las células a 1.800 veces g durante seis minutos, deseche el sobrenadante y resusppend las células con tres mililitros de tampón de lavado. Repita el lavado dos veces, luego resuspender las células en el tampón de inducción, e incubarlas durante 10 a 12 horas adicionales a 28 grados centígrados.
Después de la incubación, centrifugar las células a 1.800 veces g durante seis minutos, y deseche el sobrenadante. Resuspender las células con dos mililitros de tampón de infiltración, y determinar la concentración de bacterias utilizando el valor OD600. Agroinfiltrate hojas de Nicotiana benthamiana de cuatro semanas de edad pinchándolas suavemente con una aguja, e inyectando a mano Agrobacterium con una jeringa, luego rodea la zona infiltrada con un marcador.
Después de 36 horas, recoger el tejido de la hoja infiltrada, y molerlo en un polvo fino con nitrógeno líquido. Resuspender el polvo de tejido con 300 microlitros de tampón de extracción de proteínas, y centrifugarlo a 15.000 veces g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo, agregue el tampón de carga SDS-PAGE 5x a una concentración final de 1x y hierva la muestra durante cinco minutos.
A continuación, realice un análisis de manchas occidentales para detectar en la ubiquitinación planta. Rayar las cepas apropiadas de Agrobacterium tumefaciens que llevan genes etiquetados de interés o vector vacío, e inyectar el Agrobacterium en las hojas de Nicotiana benthamiana, como se describió anteriormente. Para la degradación de la proteína de sustrato dependiente de E3, siga el protocolo descrito anteriormente y realice la hinchazón occidental con anticuerpos apropiados para detectar la acumulación de proteínas en las células vegetales.
Para la inhibición de la muerte celular mediada por respuesta hipersensible dependiente de E3, monitoree las hojas agroinfiltradas para los síntomas de muerte celular de dos a cuatro días después de la infiltración. Un resultado típico del ensayo de ubicutinación in vitro contiene un frotis multibanda que comienza en el peso molecular de la proteína probada y progresa hacia arriba. Como era de esperar, los controles negativos que faltaban componentes individuales o el uso de MBP no demostraron la señal manchada.
Además, la tinción azul Coomassie de la membrana PVDF mostró la carga igual de MBP-RHA1B o MBP en todos los controles. Se probaron 11 E2 diferentes para investigar cómo varía la ubiquitinación in vitro dependiendo de la combinación específica de E2 a E3. La actividad de ubiquitinación detectada osciló entre la no señal y un frotis multibanda a partir de diferentes pesos moleculares, lo que indica diferentes patrones de ubiquitinación.
Las versiones RING-y K-mutant de RHA1B fueron probadas para la ubiquitinación in vitro y en planta. La falta de actividad enzimática de la versión RING-mutant se apoya en su incapacidad para generar un frotis multibanda in vitro o promover la señal de poliubiquitinación en planta. Aunque se detectó in vitro una señal marginal de autoubiquitinación para el mutante K, sólo se detectó ubiquitinación de fondo en planta, lo que sugiere que el residuo K146 también es esencial para la actividad de E3.
A diferencia del tipo salvaje RHA1B, el mutante RING que carecía de actividad ligasa E3 no interfirió con la muerte celular de respuesta hipersensible. La hinchazón occidental confirmó que el Gpa2 no se acumuló en presencia de RHA1B de tipo salvaje, pero el mutante RING no tuvo ningún impacto en la estabilidad de las proteínas. Dado que es necesaria una combinación adecuada de E2-E3 para la reacción de ubiquitinación, los ensayos de ubiquitinación in vitro deben llevarse en paralelo con múltiples enzimas E2 que representen diferentes clases de E2 para evitar resultados falsos negativos.
Un mutante con deficiencia de ligasa E3 facilita la prueba de interacciones enzimas-sustrato in vivo. Además, este mutante a menudo confiere un fenotipo negativo dominante que puede ser utilizado en estudios de knockout funcional como un enfoque alternativo al ARNi. Usando este protocolo, se ha encontrado recientemente que el efector de nematodos RHA1B interfiere con la señalización inmune de la planta de una manera dependiente de E3 al apuntar a la planta Gpa2 inmunoreceptor para la ubiquitinación y degradación.
