1 (tonos electrónicos)La optogenética bioluminiscente es una tecnología de plataforma en la que las fuentes de luz codificadas genéticamente pueden visualizar y controlar las funciones biológicas y las redes dentro y entre las células. La bioluminiscencia alcanza todos los dominios de detección de luz expresados en la población celular objetivo sin ningún daño tisular y celular por fibra óptica y exposición física prolongada a la luz. Para comenzar, comience a preparar el stock de luciferina disolviendo cinco miligramos de CTZ liofilizado en 250 microlitros de disolvente respectivo.
Asegurar la disolución de CTZ a lo largo de las paredes mediante pipeteo. Mientras protege el vial de la luz directa, prepare alícuotas de 50 microlitros en tubos de microcentrífuga negra de 0,5 mililitros y almacene las alícuotas a menos 80 grados centígrados para su uso futuro. Realice todas las manipulaciones adicionales en una habitación estrecha y luminosa en una campana de flujo laminar iluminada por luz roja.
Para realizar la estimulación de luz de bioluminiscencia única, prepare una solución de trabajo de Luciferina en un medio de cultivo celular, poco antes de agregar a las células a una concentración final de 100 micromolares. Agregue un medio que contenga luciferina a las células e incube durante la duración deseada de la estimulación de la luz. Apague la luz roja.
Después de esperar unos segundos hasta que los ojos se hayan ajustado a la oscuridad completa, monitoree la emisión de luz a ojo. Documente la emisión de luz tomando una fotografía. Termine la estimulación de la luz reemplazando el medio que contiene luciferina con el medio de cultivo, luego lave las células con el medio de cultivo una o dos veces para eliminar toda la luciferina dependiendo de la sensibilidad del experimento.
Para evitar la pérdida de células, coloque las células en platos recubiertos de PDL e incube las células. Para realizar la estimulación de luz de bioluminiscencia repetida, configure la cámara de imágenes de células vivas creando un compartimento hermético a la luz alrededor del microscopio de imágenes de células vivas utilizando una caja y láminas negras. Asegúrese de cubrir todas las fuentes de luz presentes dentro de la habitación.
Configure el sistema de perfusión con la solución deseada para la admisión y la salida de la cámara que conduce a un contenedor de residuos. Dependiendo del número de estimulaciones repetidas, alícuite la solución de imágenes de luciferina de trabajo preparada en los tubos de la microcentrífuga. Coloque una cubierta con células transfectadas en la cámara.
Mientras mantiene la bomba en funcionamiento, retire el tubo de entrada de la bomba del vaso de precipitados de admisión. Sumerja rápidamente el tubo de entrada en una solución de luciferina, manteniendo el tiempo de transición corto para evitar cualquier vacío de aire en el tubo. Tan pronto como se haya tomado la solución de luciferina, coloque el tubo de entrada de nuevo en el vaso de precipitados de admisión.
Repita la extracción y inmersión del tubo de entrada en luciferina tantas veces como sea necesario a intervalos de varios minutos a horas, dependiendo del patrón fisiológico al que se supone que las células están expuestas. Luego, mantenga las células en un ambiente protegido por la luz durante 16 a 24 horas para la transcripción o la duración hasta que se evalúe el efecto de la estimulación de la luz. Para realizar la activación de la bioluminiscencia in vivo, prepare Luciferina sacando un vial de CTZ desde menos 80 grados centígrados, luego déjelo calentar a temperatura ambiente en el área protegida por luz.
Por cada vial que contenga 500 microgramos de CTZ, añadir 250 microlitros de agua estéril con una pipeta y volver a colocar el tapón de goma sobre el vial. Incubar el vial de vidrio reconstituido en un baño de agua templado a 55 grados centígrados durante unos minutos para disolver completamente el polvo. Transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga negro y enjuague las paredes para recuperar todo el CTZ.
Después de quitar la cantidad de solución necesaria, almacene la solución restante a cuatro grados centígrados. Después de preparar, reconstituir y alícuzar el vehículo de manera similar, preforma la estimulación de luz de bioluminiscencia eliminando el volumen de luciferina o vehículo necesario para el tamaño del animal y la ruta de aplicación elegida. Inyecte al animal con luciferina o vehículo según lo diseñado.
Para la activación de la recombinasa deseada durante un paradigma de comportamiento específico, inyecte al animal justo antes de la prueba de comportamiento. Para la transcripción fásica, inyecte al animal repetidamente durante días y recopile los datos del animal estimulado por bioluminiscencia según lo diseñado. La luz rápida y el sistema de expresión regulada por la actividad permitieron la transcripción del gen reportero con un aumento de los iones de calcio intracelulares y la luz.
El LED azul condujo a una robusta fluorescencia del reportero y la expresión de FLuc se determinó mediante mediciones de luminiscencia después de la adición de luciferina. En un sistema de imágenes in vivo, tanto el LED como el CTZ aumentaron robustamente la expresión de FLuc, mientras que la presencia del componente del factor de transcripción por sí sola dio lugar a una señal de fondo considerable, posiblemente debido a la proteólisis espontánea. NanoLuc se empleó para la regulación optogénica a través de la dimerización CRY/CIB y el factor de transcripción fotosensible EL222.
La bioluminiscencia inducida por la adición de hCTZ a las células HEK-293 y su eliminación después de 15 minutos fue más eficiente que 20 minutos de exposición a LED para CRY/CIB y EL222. No se observaron diferencias significativas en la eficacia de la transcripción entre los dos sistemas cuando se co-transfectaron con hCTZ, aunque las proteínas de fusión de CRY/CIB fueron más eficientes que EL222. CRY/CIB mostró niveles de fondo consistentemente más altos en comparación con EL222 independientemente de la concentración de hCTZ.
Se probó la bioluminiscencia de una Cre recombinasa dividida fotosensible basada en la proteína VVD LOV iCreV. Los resultados de la aplicación CTZ revelaron que la presencia CTZ aumentó robustamente la expresión sobre el fondo y es similar a la aplicación LED. El uso de la bioluminiscencia para activar no solo los fotorreceptores en movimiento de hierro, sino también cualquier dominio fotosensorial agrega otra dimensión a la estimulación de la luz que expande la manipulación de las funciones celulares a través de escalas temporales y espaciales.
La optogenética bioluminiscente se ha aplicado en células y organismos modelo. Estos protocolos se pueden personalizar para probar una amplia gama de hipótesis dirigidas in vitro e in vivo.
