Este protocolo puede ayudar a mantener la estabilidad de la carga, que puede ser tanto pequeñas moléculas como proteínas, a través del uso de la poliburbuja, que a su vez puede reducir las interacciones de carbono con el disolvente. Esta novedosa técnica se puede utilizar para mejorar la cobertura de las vacunas en los países en desarrollo, ya que las funcionalidades de las vacunas a menudo pueden verse comprometidas debido a las instalaciones de transporte y almacenamiento ineficientes. Para fabricar las poliburbujas, utilice primero una pipeta de transferencia de un mililitro para añadir 800 microlitros de 10%CMC en un vial de vidrio de 0,92 mililitros.
Para sintetizar PCLTA, mezcle 1.000 gramos por mililitro de 14 kilodalton PCL en 200 microlitros de DCM. Para sintetizar PLGADA, mezcle 1.000 gramos por mililitro de cinco kilodalton PLGADA en 200 microlitros de cloroformo. Mezclar el fotoiniciador con la mezcla de polímeros de interés en una relación de 0,005 a 1 y cargar 200 microlitros de la solución resultante en una jeringa de vidrio de un mililitro montada en una bomba de jeringa conectada a un tubo de acero inoxidable dispensador con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.
Usando un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero, inyectar el polímero en el 10%CMC en el vial de vidrio para formar las poliburbujas y curar las poliburbujas bajo luz ultravioleta a una longitud de onda de 254 nanómetros durante 60 segundos a dos vatios por centímetro cuadrado, luego congelar las poliburbujas en nitrógeno líquido durante 30 segundos y liofilizar los portadores durante la noche a 0.01 miliares de vacío en menos 85 grados Celsius. Para centrar la carga de interés dentro de una poliburbuja, mezclar la carga con 5%CMC en un rotador durante la noche para aumentar la viscosidad de la carga antes de inyectar manualmente dos microlitros de la mezcla de carga en la poliburbuja. Cuando toda la carga ha sido inyectada, re-cure, congelación del flash, y liofilizar la poliburbuja inyectada como acaba de demostrar.
A la mañana siguiente, utilice fórceps para separar la poliburbuja del CMC seco y lave la poliburbuja con agua desionizada para eliminar cualquier CMC residual. A continuación, corte la poliburbuja por la mitad e imagine las mitades por microscopía confocal para asegurarse de que la carga está centrada. Para la liberación de carga de moléculas pequeñas, incubar las poliburbujas con acriflavina centrada en 400 microlitros de PBS a 37 grados Celsius para la longitud de incubación adecuada.
En cada punto de tiempo experimental, recoja el sobrenadante y añada 400 microlitros de PBS fresco al vial. A continuación, utilice un lector de placas para cuantificar la intensidad de fluorescencia del sobrenadante recogido. Para la activación de infrarrojo cercano, mezcle la solución de polímero con nanoras de oro hidrofbicizado en una proporción de uno a nueve y agregue el iniciador fotográfico a una proporción de 0,005 a 1.
Inyectar la mezcla resultante en un vial de vidrio de 0,92 mililitros que contenga 800 microlitros de 10%CMC y curar las poliburbujas bajo la luz ultravioleta como se ha demostrado. Después de la congelación flash y la liofilización como se ha demostrado, lave las poliburbujas con agua desionizada e incubar los portadores en 400 microlitros de PBS a 37 grados celsius durante el período de incubación adecuado. Al final de la incubación, obtener una imagen infrarroja con visión de futuro de la poliburbuja antes y después de activar las poliburbujas con un láser infrarrojo cercano de 801 nanómetros a ocho amperios durante cinco minutos tres veces a la semana durante cuatro semanas para las poliburbujas PLGADA y 14 semanas para las poliburbujas PCL-PCLTA.
En cada punto de tiempo experimental, recoja el sobrenadante y añada 400 microlitros de PBS fresco al vial. A continuación, calcule las diferencias de temperatura entre las poliburbujas antes y después de la activación láser en función de los valores de temperatura de las imágenes infrarrojas con visión de futuro. La adición de una solución acuosa basada en 10%CMC da como resultado una suspensión completa de poliburbujas para un mantenimiento exitoso de la esfericidad de poliburbujas.
La inyección de carga en la poliburbuja en ausencia de CMC da lugar a fugas y una consecuente falta de retención de carga dentro de la poliburbuja. Para hacer frente a esta fuga, la viscosidad de la PCLTA se puede aumentar utilizando carbonato de potasio aislado después de end capping policaprolactona con triacrilato y la viscosidad de la carga se puede aumentar mezclando la carga con 5%CMC. La viscosidad de las poliburbujas PLGADA es suficiente para facilitar el centrado de la carga y no requiere modulación a través de carbonato de potasio.
Tenga en cuenta que no se observa ninguna diferencia estadísticamente significativa en la eficiencia de unión del anticuerpo después de mezclar el antígeno VIH gp120/41 con y sin trehalosa antes de la inyección de poliburbuja. Las liberaciones de ráfagas retrasadas se observan en poliburbujas PLGADA con acriflavina a mediados del día 19 para las burburaciones incubadas a 37 grados centígrados y en el quinto día para las poliburbujas incubadas a 50 grados centígrados. Además, las poliburbujas PLGADA y las poliburbujas PCL y PCLTA que contienen nanorres de oro se pueden activar con éxito varias veces.
Al formar las poliburbujas, tenga cuidado de proteger los reactivos de la luz y también utilizar las soluciones inmediatamente. Después de desarrollar esta tecnología, también queríamos explorar la automatización de este proceso para ampliar la producción de poliburbujas.
