このプロトコルは、ポリバブルを使用することで、小分子とタンパク質の両方である貨物の安定性を維持するのに役立ち、溶媒との炭素相互作用を減らすことができます。この新しい技術は、非効率的な輸送および貯蔵施設のためにワクチンの機能が損なわれることが多いため、発展途上国のワクチンカバレッジを改善するために使用することができます。ポリバブルを製造するには、まず1ミリリットルの移入ピペットを使用して、10%CMCの800マイクロリットルを0.92ミリリットルのガラスバイアルに加えます。
PCLTAを合成するには、1ミリリットル当たり1,000グラムの14キロダルトンPCLを200マイクロリットルのDCMに混ぜます。PLGADAを合成するには、5キロダルトンPLGADAの1ミリリットル当たり1,000グラムをクロロホルムの200マイクロリットルに混ぜます。0.005対1の比率で目的のポリマー混合物とフォトイチエーターを混合し、得られた溶液の200マイクロリットルを、0.016インチの内径の分配ステンレス鋼管に接続されたシリンジポンプに取り付けられた1ミリリットルのガラス注射器にロードします。
マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前後運動を制御し、ガラスバイアルの10%CMCにポリマーを注入してポリバブルを形成し、254ナノメートル波長の紫外線下で254ナノメートルのポリバブルを平方センチメートル当たり2ワットで60秒間硬化させ、液体窒素中のポリバブルを30秒間フラッシュして0.85ミリで一晩乾燥させます。ポリバブル内の目的の貨物の中心のために、手動でポリバブルに貨物混合物の2マイクロリットルを注入する前に、手動で貨物の粘度を増加させるために、一晩の回転子で5%CMCと貨物を混合します。すべての貨物が注入されたら、再治療、フラッシュフリーズ、およびちょうど実証したように、注入されたポリバブルを凍結乾燥させる。
翌朝、鉗子を使用して乾燥したCMCからポリバブルを分離し、ポリバブルを脱イオン水で洗浄して残留CMCを除去する。その後、ポリバブルを半分にカットし、貨物が中央に配置されていることを確認するために共焦点顕微鏡で半分を画像化します。低分子貨物放出の場合、適切なインキュベーション長さのために37°CのPBSの400マイクロリットルの中心アクリフラビンを持つポリバブルをインキュベートします。
各実験時点で、上清を収集し、バイアルに新鮮なPBSの400マイクロリットルを追加します。次にプレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。近赤外活性化のために、ポリマー溶液を疎水化された金ナノロッドと1~9の比率で混合し、0.005~1の比率でフォトイニシエーターを追加します。
得られた混合物を10%CMCの800マイクロリットルを含む0.92ミリリットルガラスバイアルに注入し、実証したように紫外線の下でポリバブルを治す。フラッシュ凍結と凍結乾燥が実証された後、ポリバブルを脱イオン水で洗浄し、適切なインキュベーション期間に対して37°Cで400マイクロリットルのPBSでキャリアをインキュベートします。インキュベーションの最後に、801ナノメートル近赤外レーザーでポリバブルを活性化する前後のポリバブルを、PLGADAポリバブルの場合は4週間、PCL-PCLTAポリバブルでは14週間、週3回5分間、ポリバブルを活性化する前と後の前向きの赤外線画像を得る。
各実験時点で、上清を収集し、バイアルに新鮮なPBSの400マイクロリットルを追加します。次に、前方赤外線画像からの温度値に基づいて、レーザー活性化前後のポリバブル間の温度差を計算します。10%CMCベースの水溶液を添加すると、ポリバブルの球形を維持するために完全なポリバブル懸濁液が得られます。
CMCがない場合のポリバブルへの貨物注入は、漏れとポリバブル内の貨物保持の結果的な欠如をもたらします。この漏れに対処するために、PCLTAの粘度は、トリアクリル酸とポリカプロラクトンを終了した後に単離炭酸カリウムを使用して増加させることができ、貨物の粘度は5%CMCと貨物を混合することによって増加させることができる。PLGADAポリバブルの粘度は、貨物のセンタリングを容易にするのに十分であり、炭酸カリウムによる変調を必要としません。
なお、ポリバブル注入前にトレハロースの有無にかかわらずHIV gp120/41抗原を混合した後、抗体の結合効率に統計的に有意な差は認められない。遅延バースト放出は、摂氏37度でインキュベートされたポリバブルの場合、19日目の真ん中にアクリフラビンを有するPLGADAポリバブルで観察され、5日目には摂氏50度でインキュベートされたポリバブルに対して観察される。また、金ナノロッドを含むPLGADAポリバブルやPCLおよびPCLTAポリバブルは、何度もレーザー活性化に成功します。
ポリバブルを形成する際には、試薬を光から保護し、すぐに溶液を使用するように注意してください。この技術を開発した後、我々はまた、ポリバブル生産をスケールアップするために、このプロセスを自動化することを探求したいと考えました。
