Este protocolo demostró un método estandarizado para construir tumores tridimensionales de esferoides. Y esta metodología proporcionó un análisis de alto circuito y alto contenido de construcciones tumorales 3D. Mediante el uso de un método estándar de construcción de esferoides tumorales y un sistema de imágenes y análisis de alto rendimiento, la efectividad y precisión de las pruebas de drogas formadas en esferoides tridimensionales se puede aumentar dramáticamente.
En este protocolo, utilizamos AMG510 para tratar el esferoide NCI-H23 como ejemplo. A partir del experimento, pudimos observar un efecto significativo del fármaco dirigido canceroso en los esferoides tumorales. Para comenzar, pipetear 100 microlitros de reactivo antiadherencia en cada pocillo de una placa de 48 pocillos con un fondo de pozo en forma de U y mantener durante 10 minutos.
Después de 10 minutos, aspire el reactivo de recubrimiento y lave dos veces con PBS esterilizado. Coloque la placa de cultivo en una incubadora a 37 grados centígrados en aire humidificado con 5% de dióxido de carbono hasta su uso. Observe las células bajo el microscopio.
Luego, lavar las células cultivadas en un matraz T25 dos veces con PBS para eliminar el medio de cultivo y tratar las células expandidas con un mililitro de 0,25% de tripsina EDTA durante uno o dos minutos en una incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono. Confirme la forma de la célula bajo el microscopio. Y luego detener el tratamiento con tripsina aspirando la suspensión de tripsina EDTA usada en el matraz T25 y lavando las células con cuatro mililitros de medio fresco.
Transfiera toda la suspensión a un tubo de 15 mililitros y use un mililitro de medio fresco para lavar las células residuales y agregarlas al tubo. Centrifugar las células a 186,48 G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante. Agregue 10 mililitros de medio fresco al pellet de celda y pipete suavemente hasta que las celdas estén en una suspensión homogénea.
Aspire 0,1 mililitros de suspensión celular en un nuevo tubo de centrífuga. Agregue 0,9 mililitros de medio fresco y luego pipetear bien la suspensión. Extraer 10 microlitros de la suspensión celular para el recuento celular.
Repita este proceso una o dos veces y tome un valor promedio. Diluir la suspensión para alcanzar una densidad de siembra final de 50, 000 células por mililitro. A continuación, agregue 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de fondo en U de 48 pocillos.
Envuelva la película de sellado alrededor de la placa y centrifugarla a 119,35 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, retire la película protectora y agregue de cinco a ocho mililitros de agua esterilizada en el canal de agua que rodea los pozos. Incubar el plato a 37 grados centígrados durante cinco días.
No cambie ni complemente el agua del canal de agua durante este período y observe la agregación celular durante los siguientes cinco días. Para la incrustación de gel, después de sacar el gel congelado del refrigerador de menos 20 grados centígrados, colóquelo en una caja de hielo durante todo el tiempo durante el experimento. Observe los esferoides celulares bajo el microscopio.
Antes de que comience la incrustación del gel, se debe verificar nuevamente el estado de los esferoides. Retire con cuidado 150 microlitros del medio e incruste cada esferoide en el gel agregando lentamente el gel líquido desde el lado de la pared del pozo mientras mueve la punta de la pipeta preenfriada alrededor y dentro del pozo. Espere cinco minutos y si el gel no se extiende uniformemente, pipetear suavemente el gel con una punta de pipeta de 10 microlitros.
Cada pocillo contiene un esferoide tumoral, 25 microlitros de 3,5 miligramos por mililitro de gel y 50 microlitros de medio de cultivo completo. Agregue 75 microlitros de medio a los controles también. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 30 minutos hasta que la hidrogelación se complete por completo.
Confirme el estado de gelificación bajo el microscopio. Superponga 125 microlitros de medio fresco en cada muestra y cultive los esferoides durante otros 7 a 10 días. Prepare grupos de esferoides con cuatro a seis pocillos cada uno y elija al menos tres de ellos para su análisis.
Disuelva el medicamento de acuerdo con las instrucciones del fabricante y prepare soluciones de trabajo 100 veces con DMSO. Use 0.1% DMSO como control positivo y agregue 125 microlitros de medio tratado con medicamentos a cada pocillo. Vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 grados centígrados en aire humidificado con 5% de dióxido de carbono.
En esta etapa, cada pocillo contiene un esferoide tumoral, 25 microlitros de 3,5 miligramos por mililitro de gel y 175 microlitros del medio. Los controles contienen 200 microlitros del medio. Mida la viabilidad del esferoide utilizando un kit de ensayo alamarBlue de acuerdo con las directrices del fabricante.
Aspirar 100 microlitros del medio sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de ensayo. Luego, mida la viabilidad usando un fotómetro de microplaca. Mida el día uno, el día cuatro, el día siete y el día 10 después de incrustar los esferoides en el gel.
Agregue 80 microlitros de medio fresco a cada pocillo de la placa de cultivo. Luego reemplace otros 100 microlitros del medio tratado con medicamentos. Asegúrese de que no haya restos de alamarBlue en el pozo.
Aspire 100 microlitros del medio antes de obtener imágenes y coloque la placa en el escenario. Obtenga imágenes digitales de los esferoides utilizando un microscopio automatizado con un objetivo diez veces mayor. El microscopio puede enfocar y centralizar estos esferoides automáticamente.
Espere la imagen automática. Se adquieren cuatro imágenes para cada esferoide. Se forma y procesa una imagen integrada con el software conectado al sistema de imágenes de alto contenido.
Haga clic en el botón de proceso de parche de imagen y elija las imágenes integradas en el software. Elija el modelo U net y escriba la tasa de conversión. Haga clic en la parte inferior de la pantalla para iniciar el procesamiento de imágenes.
Guarde los datos de diámetro, perímetro y rugosidad en el software de hoja de cálculo. Finalmente, agregue 100 microlitros de medio fresco con el medicamento y vuelva a colocar la placa en la incubadora a 37 grados centígrados en aire humidificado con 5% de dióxido de carbono. En esta figura se muestran las imágenes de campo claro de los esferoides celulares NCI-H23 tratados con diferentes concentraciones de AMG510 y capturados automáticamente por un microscopio de alto contenido.
Las columnas representan diferentes días y las filas representan diferentes concentraciones de fármaco. Los resultados incluyen tres esferoides para cada condición. La viabilidad del esferoide tumoral de los grupos de muestra tratados con AMG510 se midió el día uno, el día cuatro, el día siete y el día 10.
La viabilidad de las células terminales de las muestras con gradientes de concentración se muestra en esta figura. Los diámetros de los esferoides tumorales se midieron el día uno, el día cuatro, el día siete y el día 10. La relación de crecimiento del esferoide se definió como el volumen terminal en relación con el volumen original y se calculó utilizando los diámetros de los esferoides.
La relación de inhibición del crecimiento de esferoides se definió en relación con el volumen y se calculó utilizando los diámetros de los esferoides. La rugosidad del tumor fue medida por el software el día uno, el día cuatro, el día siete y el día 10, lo que indica la invasividad de los esferoides tumorales. El perímetro del esferoide fue localizado y dibujado por el software utilizando algoritmos de aprendizaje profundo.
Las áreas esferoides en el plano focal se midieron con la imagen J y se calculó un índice de exceso de perímetro basado en estos datos. Aunque este mensaje es fácil de seguir, las muestras aún deben manejarse con cuidado.
