Nuestro método permite el estudio de los vasos sanguíneos ubicados en estructuras que de otro modo serían difíciles de imaginar en Vivo, como el hipocampo. Debido a que los vasos sanguíneos se extraen del tejido cerebral, la señalización entre los capilares y la arteriola se puede estudiar sin efectos fuera del objetivo en el tejido circundante. Para aislar el hipocampo, usa pequeñas tijeras de disección para cortar la piel a lo largo de la línea media en la parte superior de la cabeza del ratón y mover la piel hacia los lados.
Comenzando en el lado caudal del cráneo, corte el cráneo a lo largo de la línea media hasta que se alcancen los bulbos olfativos y retire partes del cráneo hasta que el cerebro esté expuesto. Comenzando cerca de la nariz del ratón, retire lentamente el cerebro, usando las tijeras para cortar a través de los bulbos olfativos, los nervios craneales y la médula espinal. Sumerja el cerebro, el lado ventral hacia abajo en MOPS Buffered Saline, en el centro de una placa de disección, y coloque la placa debajo de un microscopio de disección.
Sosteniendo el borde afilado paralelo a la parte inferior de la placa, utilice cuchilla de afeitar para cortar el cerebro por la mitad a lo largo de la fisura longitudinal en un solo golpe. Coloque un hemisferio en el centro de la placa con la línea media hacia abajo y empuje la cuchilla de afeitar directamente a través del tejido a lo largo de la fisura transversal para eliminar el cerebelo y el tallo cerebral. Gire el hemisferio de modo que el lado medial esté mirando hacia arriba y use una espátula para mantener el cerebro en su lugar.
Inserte la punta de una segunda espátula debajo del cuerpo calloso, recogiendo debajo del tejido para extraer el tálamo, el tabique y el hipotálamo del hipocampo. El hipocampo ahora debe ser visible como una estructura curva cerca del lado posterior del cerebro. Usando una espátula para mantener el cerebro en su lugar, usa la segunda espátula para sacar el hipocampo del cerebro.
A continuación, transfiera el hipocampo a una nueva placa de disección, llena a mitad de camino con una solución MOP fresca. Para el aislamiento de arteriole hipocampal, coloque pequeños alfileres en cada extremo de un hipocampo para asegurar la muestra de la arteria hipocampal hacia arriba. Usando fórceps muy afilados, estira suavemente pequeñas secciones del hipocampo para aflojar el tejido que rodea las arterias.
Y busque a través de los tejidos del hipocampo dorsal para identificar las arterias transversales externas. Cuando la arteria haya sido localizable, agarra la arteria transversal externa del hipocampo y aparta lentamente del tejido para recoger las arterias y capilares. La arteria de cada hipocampo se extrae por separado.
Cuando no haya más vasos que extraer, coloque las muestras sobre hielo y deseche el tejido del hipocampo restante. Para la cánulación de las arterias, localice y arteriole con una rama que termina con capilares y coloque la arteriola en una cámara de órganos. Empuje con cuidado la punta de la cánula a través de la pared de la arteria debajo del área objetivo para montar el vaso sanguíneo.
Luego, deslice cuidadosamente el recipiente sobre la cánula hasta que haya suficiente tejido en el que colocar la corbata. Usa 12-0 suturas de nylon para hacer un nudo suelto que que quepa sobre el vaso sanguíneo y la cánula, y usa un nudo de medio enganche para asegurar las ataduras, tira de los extremos para apretar el nudo para asegurar la arteria a la cánula. Asegure otra corbata en el otro extremo de la arteria para sellarla.
En el lado opuesto de la cámara, baje una segunda cánula hasta que el punto de la cánula pin abajo la corbata en el extremo de la arteriola. A continuación, utilice una tercera cánula para fijar la rama capilar al cubreobjetos, colocando la punta cerca del final de la rama, dejando los extremos de los capilares expuestos. Como la microcirculación cerebral es exquisitamente frágil, asegúrese de minimizar el estiramiento y el manejo de los vasos durante el procedimiento de canulación para asegurar la supervivencia de las arteriolas.
Para el análisis de la mimografía por presión, transfiera la cámara a una etapa de microscopio de luz con software de grabación y conecte el tubo de entrada y salida a la cámara para su profusión. Inicie la profusión con 37 grados Celsius Líquido cefalorraquídeo artificial a un caudal de cuatro mililitros por minuto, y conecte la cánula de presión a la bomba peristáltica emparejada con un transductor de presión. Lleve la presión interna a 20 milímetros de Mercury e inicie el software de grabación.
Ajuste el microscopio y los ajustes de imagen para lograr la imagen más clara posible. Y utilice el software de detección de bordes para comprobar que la arteriola tiene entre 15 y 30 micrómetros de diámetro cuando está completamente dilatada. Una vez optimizados los ajustes, comience la grabación y aumente la presión intravascular en el recipiente hasta 40 milímetros de Mercurio, mientras registra el diámetro de la arteriola con el software de detección de bordes.
A continuación, profuse la cámara durante 15 a 20 minutos para lavar la solución MOP. Para probar la viabilidad del recipiente, aplicar una solución de micromolar NS309 a la profusión del baño, el segmento arteriolar debe dilatarse, demostrando un tono miogénico de 30 a 40%. Una vez que se haya establecido el tono de referencia para la arteriola, utilice un tirador de vidrio para hacer cánulas con un punto fino en un extremo, y use fórceps para romper la punta de cada cánula, de modo que la droga de interés pueda fluir suavemente a través de la punta a cinco libras de presión por pulgada cuadrada.
Llene la cánula con la droga de interés. Y cargue la cánula en un micromaniprógrafo de tres ejes unido al microscopio. Conecte el tubo del sistema de eyección de presión a la cánula, y baje lentamente la cánula en el baño cerca de los capilares, teniendo cuidado de no golpear ninguna parte del recipiente o la cámara.
Para estimular los capilares, baje la cánula a la cubierta justo al lado de los capilares y active el sistema de eyección de presión con el tiempo de eyección deseado. Al final de la estimulación, levante ligeramente la cánula para evitar una mayor estimulación. Para confirmar que sólo se estaban estimulando los capilares, llene la nueva cánula con un micromolar de solución NS309 y estimule los capilares como se ha demostrado.
A continuación, obtener la vasodilatación máxima mediante el baño de la preparación con la solución libre de calcio. La aplicación de baño de un micromolar NS309 causa una dilatación casi máxima de la arteriola debido a los canales de potasio sensibles al calcio en el endotelio. Células endoteliales capilares sin embargo, carecen de canales de conductancia intermedios y pequeños y no hiperpolarizan en respuesta al agonista, como resultado, estimulando los extremos capilares con NS309, no causa dilatación arteriolar aguas arriba, esto indica que NS309 no llegó a la arteria, y se puede utilizar como control para acceder a la restricción de spa del compuesto aplicado en los capilares por eyección de presión.
Utilizando la preparación de arteriollado parénquimal capilar hipocampal como se demostró, la aplicación de un líquido cefalorraquídeo artificial complementado con 10 mililitros de potasio a los extremos capilares, da como resultado una dilatación arteriolar aguas arriba que no difiere entre las preparaciones de ratones machos y hembras. Además, la adición del inhibidor de Kir2 ML 133, prácticamente abolia la dilatación arteriolar inducida capilar, en respuesta a 10 mililitro de potasio en preparaciones de ratones machos y hembras. Al montar la vesssel de sangre, limite las interacciones directas con el vaso sanguíneo para minimizar el daño y aumentar la viabilidad del vaso.
Una vez que el vaso sanguíneo ha sido aislado, diferentes compuestos farmacológicos pueden ser probados o el vaso sanguíneo se puede procesar más para la biología olecular, inmunoquímica, o estudios de electrofisiología.
