Name: isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles
Uploaded: 2016-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
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Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

1. cánula y cámara de preparación de <ol><li> Inserte capilares de vidrio de borosilicato limpia (diámetro exterior: 1,2 mm; diámetro interior: 0,69 mm; 10 mm de longitud) en las ranuras de un extractor de pipeta con un filamento de platino (diámetro: 100 micras). </li><li> Utilización de las configuraciones adecuadas, tire del capilar para generar una cánula con una punta larga y delgada (Figura 2) utilizando un extractor de micropipeta. Los ajustes que se utilizan son: Heat - 700, Pull - 100, velocidad - 50, Tiempo - 10. </li><li> Insertar la cánula en el soporte de la cámara de myograph presión. Alinear las cánulas apropiadamente. </li><li> romper cuidadosamente la punta de las cánulas mediante el uso de un fórceps bajo el microscopio de disección para el diámetro deseado. Aquí mostramos una cánula con una punta de 10 mm (Figura 2). </li><li> Llene los dos cánulas con líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contiene 1,8 mM de Ca2 +; llenar la cámara con Ca 2 + libre LCRa suplementado con suero bovino 1%albúmina (BSA) + 10 M Diltiazem (todas las soluciones se deben preparar fresco antes del comienzo del experimento). Dependiendo del tamaño de la cámara, variar el volumen de LCRa entre 5 a 20 ml. Almacenar la cámara a 4 ᵒ C hasta que esté listo para comenzar la canalización. NOTA: Diltiazem es un inhibidor de calcio cerrada tensión reversible de tipo L que hará que la dilatación de las arteriolas, lo que facilita la canulación </li></ol> 2. Aislamiento del parénquima arteriolas <ol><li> La eutanasia del animal inmediatamente antes de la disección a través de protocolos estándar en el laboratorio que se aprobado por el comité de cuidado de animales de la institución. Se prefiere el uso de barbitúricos o dióxido de carbono, como otros anestésicos usados ​​comúnmente pueden tener efectos vasodilatadores en la circulación cerebral 15. Todos los animales procedimientos mostrados aquí han sido aprobados por Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Nevada, Facultad de Medicina, y están en agreement con los Institutos Nacionales de la Salud &quot;Principios rectores en el Cuidado y Uso de los Animales&quot;. </li><li> La eutanasia a los animales utilizando dióxido de carbono. Antes de la decapitación, asegúrese de que el animal ha dejado de respirar y no responde cuando se pellizca sus patas. </li><li> Decapitar al animal usando una tijera afilada (ratón) o guillotina (rata). Quitar la piel de la cabeza del animal y cortar a lo largo de la sutura craneal línea media usando una tijera de punta fina. Usando unas pinzas romas (ratón) o una pinza de hueso retirar con cuidado los huesos del cráneo y exponer el cerebro. Retire el cerebro lentamente y con cuidado para no dañar las arterias pial superficie. Coloque el cerebro en un recipiente lleno con 20 ml de Ca 2 + libre LCRa suplementado con 1% de BSA en hielo. </li><li> Llenar un plato de disección que contiene una almohadilla con helado libre de Ca2 + LCRa suplementado con 1% de BSA y transferir el cerebro con la superficie ventral hacia arriba a este plato (Figura 2A). Coloque el plato bajo una disecciónmicroscopio Ting (Figura 3A). Pin el cerebro a la plataforma usando agujas de calibre 27. Tenga cuidado de evitar la colocación de pasadores, cerca de la arteria cerebral media (ACM). </li><li> Localizar el Círculo de Willis y el MCA ramificación de ella. Con unas tijeras afiladas y alineadas primavera Vannas, cortar un pequeño rectángulo alrededor de la MCA. Asegúrese de que rectángulo es cerca de 5 mm de diámetro a través de toda la longitud de la MCA. La parte superior del rectángulo debe estar más allá del punto de ramificación del Círculo de Willis (próxima al polígono de Willis, la figura 2B, flecha). </li><li> Uso de las tijeras de primavera Vannas, realice un corte en la profundidad del tejido durante aproximadamente 2 a 3 mm. NOTA: Esta parte es fundamental para un buen aislamiento de las arteriolas del parénquima, y ​​puede tomar unos pocos ensayos para hacerlo bien. Si el corte es la nota hecha lo suficientemente profundo, las arteriolas aisladas del parénquima será corta; Si el corte es demasiado profundo, las arteriolas se romperá en su punto de ramificación cuando el diseccionadoSe extirpa el tejido. </li><li> Precisar el extremo más distal de la sección de cerebro en el plato de disección con la CRM hacia arriba (distal del Círculo de Willis) usando pasadores de insectos. Hacer una incisión poco profunda para cortar la pia cerca del pasador, teniendo cuidado de no cortar demasiado profundamente en la corteza cerebral subyacente (de lo contrario los pines no se mantendrá). </li><li> agarrar con cuidado cada lado de la pia con pequeñas pinzas y comenzar el pelado de la pia de la corteza. Si es necesario, se aferran a la MCA, asegurando que la membrana pial circundante no está dañado. </li><li> Mantenga pelar hasta que la pia que contiene la MCA está libre de la corteza. Tenga en cuenta que la resistencia contra el pelado aumentará cerca del Círculo del Willis. Tenga mucho cuidado en este punto, debido a que las arteriolas del parénquima más largos estarán en esta región. </li><li> Una vez que la PIA es libre, lo coloca cuidadosamente en la parte superior de la almohadilla en el plato de disección con la superficie opuesta a la del parénquima arteriolas orientados hacia abajo (Figura 2B). </li> &lt;li&gt; Uso de tijeras de primavera Vannas, cortar las arteriolas disecados libres de la CRM, asegurándose de que los extremos del vaso se cortan sin rodeos. </li><li> arteriolas recogidos pueden ser utilizados para myography presión, el análisis molecular, o el aislamiento de músculo liso nativo o células endoteliales. </li></ol> Miografía 3. Presión <ol><li> Preparar la sutura antes de tiempo. Cortar el hilo de nylon de color verde oscuro en piezas de 5 mm y colocar en el lado adhesivo de una cinta de doble cara en una placa de Petri. Bajo el microscopio de disección, separar cada pieza en sus filamentos utilizando unas pinzas finas, y sin apretar preparar un nudo simple medio nudo haciendo pasar un extremo del filamento en la otra. </li><li> Con unas pinzas, elegir un nudo de la cinta de doble cara, teniendo cuidado de no agarrar con demasiada presión. Tirar de la sutura en la solución del baño, nudo deslizante en la cánula y apretarlo a una distancia desde la punta de la cánula. Repita este proceso para tener 2 puntos de sutura en cada cánula. </li><li> Escudo un vasomicropipeta con una solución de BSA al 10% y luego enjuague el exceso con Ca 2 + LCRa exento suplementado con 1% de BSA. </li><li> Tire 50 l de solución en la micropipeta de vidrio, tire hacia arriba de una arteriola del parénquima y la transferencia a la cámara de presión myography. Empuje émbolo en un movimiento fluido para dispensar la arteriola del parénquima en la cámara para evitar que se pegue a la cámara interna de la micropipeta de vidrio. </li><li> El uso de dos pinzas de la multa estupenda, abrir el lumen del PA, con cuidado de tocar solamente el final de la embarcación. </li><li> Usando las pinzas para sujetar los bordes de la arteriola del parénquima, tire con cuidado el recipiente sobre la cánula. Tire lo suficientemente lejos en la cánula de modo que el buque no está en el extremo muy afilada de la cánula (Figura 3A). </li><li> Aflojar los 2 puntos de sutura en la cánula y apretarlos en el buque (Figura 3B). Espacio de las suturas separadas un poco en el recipiente, y tire hacia el operador, mientras que tighcada diez. Asegúrese de que las ramas se atan antes de cerrar el extremo opuesto de la arteriola del parénquima. </li><li> Girar cámara alrededor y cerrar el extremo opuesto de la arteriola parénquima como una persiana salida. Para ello, abrir los lazos en la cánula opuesto y dárselo a la arteriola. Cierre lentamente el nudo de tal manera que la arteriola parénquima estará ligado a un lado de la cánula. Evitar el estiramiento longitudinal de la arteriola. (Figura 3C). NOTA: Si el objetivo del estudio es para perfundir los medicamentos a través del lumen, canular el extremo opuesto en lugar de atar la arteriola del parénquima en el lado de la cánula. Asegúrese de que las cánulas no tienen cristales de sal o acumulaciones internas que bloquean el flujo intraluminal. Regular la velocidad de flujo apropiada a fin de mantener la tensión de cizallamiento dentro de los niveles fisiológicos. Un estudio realizado por Shih et al. Muestra las tasas de flujo en el interior de penetración arteriolas en ratas de 8, y puede servir como una guía inicial para piLos estudios mucho. </li><li> transferir con cuidado la cámara a la platina del microscopio para ser utilizado para la grabación de diámetro de los vasos. Coloque la cámara en la platina del microscopio, la conexión de la sonda de temperatura y entradas y salidas para la perfusión a los tubos correctos. Presurizar la arteriola a 40 mmHg de presión intraluminal para arteriolas del parénquima de ratón o de 50 mmHg para arteriolas de rata, usando un sistema de presión disponible en el laboratorio (columna de agua, bomba peristáltica acoplada a un transductor de presión, etc.). La Figura 4D muestra un ejemplo de una bomba peristáltica acoplada a un transductor de presión para presurizar la arteriola canulado. </li><li> Encienda el sistema se utiliza para detectar cambios en el diámetro (Figura 3E). Ajustar la configuración de un microscopio, tales como la iluminación y el contraste, con el fin de obtener la mejor detección posible. Lo ideal sería que las paredes de las arteriolas deben ser oscuro y la luz translúcida. Una vez que la detección es el caso, iniciar la grabación tque experimentar. </li><li> Iniciar el sistema de superfusión. Lavar el canulado, arteriola parénquima presurizado con LCRa caliente (37 ᵒ C) que contiene mM Ca 2 + 1,8 para 15 a 20 minutos a una velocidad de flujo entre 3-5 ml / min. Este ACSF no debe contener Diltiazem o BSA. </li><li> Sustituir el LCRa regular con 60 mM KCl LCRa para evaluar la viabilidad de la preparación. En este punto las AP deben exposición 10 - 20% de la constricción de KCl 60 mM. Si la arteriola no se contraen en esa medida, quitar y cannulate otra de las arteriolas. </li><li> Lavar el KCl 60 mM con ACSF regular. Espere hasta que la generación del tono miogénico espontánea, lo que podría tardar hasta una hora. Si arteriolas no tiene tono miogénico para entonces, sustituirla por otra de las arteriolas. NOTA: miogénica tono se observa como un gradual, y a veces lento, la reducción del diámetro de la luz del vaso sin estimulación por agonistas contráctiles o solución de alta KCl. tono miogénico se calcula mediante la siguiente formula: (1 - (diámetro de lumen activo / diámetro lumen pasivo)) x 100 5 Una cantidad apropiada de tono miogénico puede variar de acuerdo a los tratamientos, las cepas, especies, transgénicos, etc.. En general, el tono miogénico fisiológica oscila desde 15 hasta 30% 5. </li></ol> 4. Ejemplo de presión Experimentos Miografía: inducida por agonista constricción y miogénica reactividad <ol><li> Preparar una serie de diluciones de un agonista de elección en LCRa usando concentraciones apropiadas. Para el ejemplo actual se utilizó el U46619 agonista del receptor de tromboxano A 2. Se preparó una solución madre de 1 ml de U46619 a una concentración de 1 mM. Transferir 100 l de la solución 1 mM a un nuevo tubo que contiene 900 l de LCRa para hacer una dilución de 10 veces de la droga, lo que resulta en una solución que contiene 100 U46619 M. Repita este procedimiento para 6 diluciones, que van desde 1 mM a 100 nM para preparar una curva de concentración-respuesta constrictor. </li><li> Añadir latodo el volumen de la solución que contiene el agonista (1 ml para la primera dosis, seguido de 900 l de todas las dosis subsiguientes) a 100 ml de superfusión LCRa. Esto dará lugar a una dilución adicional de 100 veces del agonista. Por lo tanto, las concentraciones finales de agonista en el intervalo de baño de 10 pM a 10 mM. Permitir arteriolas incubar durante ~ 10 min en cada concentración, hasta el diámetro de la luz alcanza un estado estacionario. </li><li> Lavar el agonista por superfusión AP de ACSF sin ninguna droga hasta que el diámetro PA está de nuevo al valor original. Incubar la arteriola del parénquima en Ca 2 + libre de LCRa (sin BSA) suplementado con 10 mM Diltiazem + 2 mM EGTA para inducir la dilatación máxima y registrar diámetro pasiva de la arteriola. </li><li> Retire la arteriola del parénquima de la cánula tirando con cuidado a cabo mientras se mantiene en el extremo de los lazos. Se lava la cámara de recipiente con agua doblemente desionizada para eliminar los desechos y el exceso de agonista. Llenar la cámara con Ca2 + LCRa + exento de BSA y cannulate otra de las arteriolas. No se recomienda realizar más de un experimento por las arteriolas. </li><li> Para llevar a cabo un experimento de reactividad miogénica, permite la arteriola del parénquima se equilibre a 40 mmHg de presión intraluminal hasta que se genera el tono miogénico espontánea (descrito anteriormente). Reducir la presión intraluminal de 5 mmHg y permitir que se equilibre durante PA ~ de 5 - 10 minutos, hasta que el diámetro luminal alcanza el estado de equilibrio. Aumentar la presión paso a paso intraluminal utilizando el intervalo de elección (por ejemplo de 5 a 140 mmHg en incrementos de 20 mm de Hg). </li><li> No exponga la arteriola a la presión intraluminal por debajo de 5 mmHg, ya que ello podría causar el colapso y dañar el endotelio, alterando así los resultados del experimento. </li><li> Al final de la curva de presión, superfuse la arteriola parénquima con Ca 2 + libre de LCRa (sin BSA) suplementado con 10 mM Diltiazem + EGTA 2 mM y repetir los pasos de presión, a partir de los lowest presión. NOTA: Esto le dará a los diámetros pasivos de la AP, que son necesarios para calcular el% tono miogénico, definidos por la fórmula:% tono = (1 - (diámetro activa / pasiva de diámetro)) x 100. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

arteriolas del parénquima cerebral son las arteriolas de alta resistencia con pocas anastomosis y ramas que irrigan distintas poblaciones neuronales. Estos vasos sanguíneos especializados son actores centrales en la autorregulación cerebrovascular y acoplamiento neurovascular a través de la vasodilatación mediada por astrocito-1. La importancia de estos vasos sanguíneos especializados en la enfermedad vascular cerebral se conoce desde hace aproximadamente 50 años, cuando el trabajo pionero del Dr. Mill...

La circulación cerebral se organiza única para apoyar las demandas metabólicas de las neuronas centrales, las células que han limitado las reservas de energía y en consecuencia son muy sensibles a los cambios en la presión de oxígeno y el suministro de nutrientes necesarios. Como determinadas subpoblaciones neuronales se vuelve activo cuando se realizan tareas específicas, la vasculatura promueve un aumento muy localizada en la perfusión para evitar la hipoxia local y el agotamiento de los nutrientes 1. Esta es una forma de hiperemia funcional conocido como acoplamiento neurovascular, y depende de la operación correcta de la unidad neurovascular, compuesto de neuronas activas, astrocitos y las arterias cerebrales 2. Arteriolas parenquimatosas intracerebral, un grupo de los vasos sanguíneos que abarcan del parénquima, penetrantes y arteriolas pre-capilares, son centralmente importante para esta respuesta y entonces es fundamental para estudiar de forma individual con el fin de investigar el acoplamiento neurovascular 3. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; arteriolas parenquimatosas son pequeñas (20 a 70 micras de diámetro interno) los vasos sanguíneos de alta resistencia que perfunden distintas poblaciones neuronales en el cerebro. Diversificación de las arterias pial en la superficie, arteriolas parenquimatosas penetran en el parénquima cerebral en un ángulo de casi 90 ᵒ para alimentar la microcirculación subsuelo (Figura 1). Estas arteriolas juegan un papel crítico en el mantenimiento de la presión de perfusión adecuada, ya que son los vasos que contiene músculo liso más distales que protegen a los capilares. En contraste con la circulación pial superficie, arteriolas parenquimatosas carecen de ramas colaterales y anastomosis, y por lo tanto son &quot;cuellos de botella&quot; de la circulación cerebral 4. Como resultado de ello, la disfunción de las arteriolas del parénquima contribuye al desarrollo de las enfermedades cerebrovasculares tales como deterioro cognitivo vascular y pequeños accidentes cerebrovasculares isquémicos (también conocido como accidentes cerebrovasculares silenciosos o lacunares). estudios iNDICATe que la disfunción del parénquima arteriolas puede ser inducida por la hipertensión esencial 5, el estrés crónico 6, y es un evento temprano en la enfermedad de vasos pequeños modelo de ratón genético 7. Oclusión Además, inducida experimentalmente de las arteriolas penetrantes individuales en ratas es suficiente para provocar pequeños accidentes cerebrovasculares isquémicos que son de forma cilíndrica, similar a los observados en los seres humanos de edad avanzada 8. Además de estas distinciones anatómicas, mecanismos que regulan la función contráctil difieren entre arterias y arteriolas pial parenquimatosas. Vasoconstricción miogénica es mayor en las arteriolas del parénquima 9, posiblemente debido a la falta de inervación extrínseca 10, modos distintos de mechanotransduction 11, y las diferencias en la señalización intracelular de Ca2 + 12,13 en las células del músculo liso vascular. La evidencia sugiere que los mecanismos vasodilatadores dependientes del endotelio también difieren entre estos Vascusegmentos lar, con arterias del parénquima que exhiben una mayor dependencia de los mecanismos que implican Ca2 + activados por los canales de K + y la comunicación electrotónico dentro de la pared vascular en comparación con los factores difusibles como el óxido nítrico y prostaciclinas 14. Por lo tanto, los datos reunidos en experimentos utilizando arterias pial no necesariamente puede aplicarse a las arteriolas del parénquima, dejando un vacío en nuestro conocimiento del control local de la perfusión cerebral. A pesar de su importancia, las arteriolas del parénquima son muy insuficientemente estudiada, principalmente debido a las dificultades técnicas con el aislamiento y el montaje para el estudio ex vivo. En este manuscrito se describe una metodología para aislar y canular arteriolas del parénquima cerebral, que puede ser utilizado para myography presión, o para aislar el tejido para immunolabeling, la electrofisiología, la biología molecular y el análisis bioquímico.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Artificial Cerebrospinal Fluid&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Isolation/Cannulation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &amp;mu;l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Sterile Syringe Filter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dark Green Nylon Thread</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Single Vessel Chamber</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heating Unit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles

arteriolas del parénquima intracerebrales (AP), que incluyen las arteriolas, arteriolas penetrantes del parénquima y arteriolas pre-capilares, vasos sanguíneos son de alta resistencia que ramifican hacia fuera de las arterias y arteriolas pial y el buceo en el parénquima cerebral. PA individual perfundir un territorio cilíndrica discreta del parénquima y las neuronas que contiene. Estas arteriolas son un actor central en la regulación del flujo sanguíneo cerebral tanto a nivel mundial (autorregulación cerebrovascular) y local (hiperemia funcional). AP son parte de la unidad neurovascular, una estructura que coincide con el flujo de sangre regional a la actividad metabólica en el cerebro y también incluye neuronas, interneuronas, y astrocitos. La perfusión a través de las AP está directamente relacionada con la actividad de las neuronas en ese territorio particular, y el aumento de plomo metabolismo neuronal a un aumento en la perfusión de la zona por la dilatación de la alimentación de PA. Reglamento de las AP difiere de la de mejor caracterizadopial arterias. vasoconstricción inducida por presión es mayor en las áreas protegidas y los mecanismos vasodilatadores varían. Además, las áreas protegidas no reciben inervación extrínseca de los nervios perivasculares - inervación es intrínseca e indirecta en la naturaleza a través del contacto con los pies terminales astrocíticos. Por lo tanto, los datos relativos a la regulación contráctil acumulados por los estudios que utilizan arterias pial no se traduce directamente a la comprensión de la función PA. Además, sigue sin determinarse cómo los estados patológicos, como la hipertensión y la diabetes, afectan a la estructura y reactividad PA. Esta brecha de conocimiento es en parte consecuencia de las dificultades técnicas relacionadas con el aislamiento de PA y la canalización. En este manuscrito se presenta un protocolo para el aislamiento y la canalización de las AP de roedores. Además, se muestran ejemplos de experimentos que se pueden realizar con estas arteriolas, incluyendo constricción inducida por el agonista y reactividad miogénica. Aunque el objetivo de este manuscrito es el PA canulación y myography presión, aislado PAs también se puede utilizar para estudios bioquímicos, biofísicos, moleculares y de imagen.

La Figura 5A muestra una constricción representante de las AP de ratón a 60 mM KCl LCRa para evaluar la integridad de la preparación. AP debe constreñir entre 15 - 30% en presencia de KCl 60 mM. Si el estrechamiento es inferior al 15%, desechar la AP y cannulate otro, ya que sugiere que la arteriola fue dañado durante el proceso de aislamiento y la canalización. La Figura 5B ilustra PA c...

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Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

El aislamiento y la canulación del parénquima cerebral arteriolas

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K vistas.  University of Nevada School of Medicine. This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

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Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Permanente oclusión vascular cerebral<em&gt; Vía</em&gt; Ligadura doble y transección

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Investigación

Medicina

Comprehensive Endovascular and Open Surgical Management of Cerebral Arteriovenous Malformations

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs must be tailored specifically to the lesion, with surgical resection being the gold standard for small, accessible lesions. Pre-operative embolization of AVMs can reduce nidal blood flow and remove high-risk AVM features such as intranidal or venous aneurysms, thereby simplifying a challenging neurosurgical procedure. Herein, we describe our approach for the staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and highlight the advantages of having a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team. This includes planning the craniotomy and resection to immediately follow the final embolization stage, thereby using a single session of anesthesia for aggressive embolization, and rapid resection. Finally, we provide a representative case of a 22-year-old female with an unruptured right frontal AVM diagnosed during a seizure workup, who was successfully treated via staged embolizations followed by open surgical resection.

Surgery is the gold standard for accessible arteriovenious malformations (AVMs), and pre-operative embolization can simplify this procedure. We describe our approach for staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and provide a representative clinical example highlighting the advantages of a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team.

Integral Endovascular y abierta la gerencia quirúrgica de las malformaciones arteriovenosas cerebrales

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs ...

Neurociencias

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Evaluación de mecanismos de Control Vascular utilizando microscopia Video de arterias de resistencia aislada de ratas

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo Presurizado Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparación para Estudio Funcional

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Biología

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Optimization of the Longa Middle Cerebral Artery Occlusion Method for Complete Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three decades, its standardization remains inadequate. Predominantly conducted on rats and mice, the procedure poses challenges due to mice's smaller and more fragile nature. Unlike the Koizumi common carotid artery method, the Longa external carotid artery is the sole intraluminal filament stroke model ensuring complete reperfusion post-ischemia. This aspect holds critical significance for studies investigating reperfusion phenomena. The surgical modifications demonstrated in this article ensure continuous blood flow from the common carotid artery throughout the ischemic phase and after the reperfusion onset. The goal of these modifications is to selectively occlude the middle cerebral artery by keeping the perfusion uninterrupted in branches proximal to the middle cerebral artery during the ischemia period. Furthermore, the onset of reperfusion is sudden and can be precisely controlled, thereby modeling endovascular thrombectomy in human medicine more accurately. Our aim in presenting this comprehensive video article is to ease the training of new surgeons and promote the standardization of surgical procedures within the scientific community.

This protocol presents a step-by-step guide for researchers to perform the middle cerebral artery occlusion procedure on mice using the modified Longa external carotid artery method. Modifications presented in this article aim to increase the accuracy of middle cerebral artery occlusion and ensure complete reperfusion.

Optimización del método de oclusión de la arteria cerebral media de Longa para la reperfusión completa

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Aislamiento y análisis funcional del endotelio arteriolar del parénquima cerebral de ratón

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Source: Hakim, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/63463">Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Preparación de tubos endoteliales cerebrales a partir de arteriolas parenquimatosas de ratón

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1.&#160;Solutions and drugs

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