El objetivo general del protocolo es aislar las células primarias de microglia de los tejidos cerebrales humanos adultos vivos. En nuestro caso, esto se recogió como ventana quirúrgica durante la cirugía. Esto se logra mediante la recolección inicial de los tejidos cerebrales en pbS frío hielo, el tejido se corta en cubos de 1 mm piezas pequeñas, y acabo de hacerlo con la ayuda de la trippsina EDTA.
Después de esto, las células se cosechan por centrifugación y se vajilla en un matraz adecuado para el cultivo de células de andrógenos durante 48 horas. Las células se cosechan una vez más del matraz y se cultivan hasta su uso posterior. Las células primarias de microglia humana ahora se pueden caracterizar mediante el uso de inmunocitoquímica y utilizarse para experimentos adicionales.
La principal ventaja de nuestro protocolo para aislar las células de microglia de los tejidos cerebrales humanos adultos es que proporciona eficazmente células de microglia humanas adultas primarias de una manera muy rentable. El protocolo es robusto y reduce la pérdida de células al reducir el número de pasos que se utilizan en los protocolos existentes. Recoger el tejido en un tubo Falcon de 50 ml que contenga 10 ml de aCSF helado.
Limpie el tubo de recogida cuidadosamente con 70% de alcohol y transfiera a una cámara de flujo de aire laminar aséptica. Deseche el aCSF cuidadosamente y pese el tejido en el tubo Falcon. Calcular el peso aproximado del tejido deduciendo el peso del tubo Falcon vacío.
Caliente fresco aCSF a 37 grados centígrados. Mantenga el tejido en aCSF caliente durante cinco minutos. Este paso es fundamental para evitar la muerte celular.
Deseche aCSF cuidadosamente. Y lave el tejido una vez con 1X PBS calentado a 37 grados centígrados. Asegúrese de que toda la sangre se lave con lavados repetidos de PBS según sea necesario.
Incubar el tejido en PBS caliente durante 5 minutos. Deseche la mitad del PBS cuidadosamente. Transfiera el tejido junto con el PBS restante a un plato de Petri esterilizado.
Retire el PBS restante cuidadosamente con una pipeta de 1 ml. Esto evitará la pérdida de tejido. Dados que se emiten en al menos 1 mm cubo trozos pequeños utilizando un bisturí estéril.
Añadir 2 ml de 0.25%trypsin EDTA a la placa Petri y lavar la placa a fondo con la ayuda de la pipeta. Transfiera el tejido cortado en cubos a un tubo Falcon de 50 ml que contenga 10 ml por gramo de tejido de 0,25% de trippsina EDTA. Mezclar pipeteando a través de una pipeta serológica de 10 ml.
Incubar el tubo en una coctelera durante 30 minutos a 37 grados centígrados y la velocidad de 250 rpm. Añadir 10 ml de medio neutralizante para neutralizar la trippsina. Mezclar bien con una pipeta serológica de 10 ml.
Centrifugar el tubo a 2000G a 4 grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de medio de cultivo. Poner las células en un matraz T25 adecuado para células de andrógenos y añadir 4 ml de medio de cultivo adicional.
Medio de cultivo contendrá 20%L929 sobrenadante y 1%estreptomicina. Se recomienda añadir L929 sobrenadante por separado en matraces en lugar de añadir al medio de cultivo de stock. Hemos terminado con el matraz para desechar homogéneamente el tejido.
Evite llevar el soporte al cuello del matraz mientras agita, ya que esto puede aumentar las posibilidades de contaminación. Incubar el matraz a 37 grados centígrados con 5% de CO2 durante 48 horas. Recoger los medios del matraz de cultivo T25 preparado el día 0 en tubos centrífugos.
Centrifugar los medios recogidos a 1.466G a 4 grados centígrados durante 4 minutos. Mientras se centrifuga el medio recogido, lave el matraz del día 0 una vez con 1X PBS. Agitar el matraz suavemente para eliminar los fragmentos de tejido remanente que queden.
Evite el temblor brusca del matraz, ya que los fragmentos remanentes no afectarán negativamente al cultivo. Añadir 5 ml de medios de cultivo frescos al matraz. Deseche el sobrenadante de los tubos centrifugados.
Añadir 1 ml de medio de cultivo a uno de los tubos y mezclar bien con pipeta. Agregue en serie los medios mixtos con las células a otros tubos y mezcle bien. Poner las células en un matraz T25 separado adecuado para células de andrógenos.
Añadir 4 ml de medios de cultivo frescos al matraz. Incubar ambos matraces a 37 grados centígrados con 5% de CO2 durante 48 horas. Deseche el soporte de ambos matraces y añada medios de cultivo frescos de 5 ml.
Incubar los matraces a 37 grados centígrados al 5% de CO2 durante 48 horas. En el sexto día, las células estarán listas para más experimentos. En las imágenes representadas aquí.
Primer panel de la sección A astrocitos manchados con GFAP, de color verde. En el segundo panel, de la sección Una mancha de microglia con RCA, de color verde. En la sección B microglia teñida con RCA, que es de color verde, y los astrocitos se tiñen con GFAP, de color rojo.
La superposición de las imágenes muestra microglia y astrocitos juntos. De las imágenes se desprende claramente que la mayoría de las células del cultivo preparados son microglia. Las imágenes fueron cuantificadas por control cegado y el resultado se representa en la sección C.Los resultados mostraron que alrededor del 80% de las células en el cultivo preparados son células de microglia.
Esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora y media. Después de este procedimiento debe tener una buena comprensión de cómo selecciono la microglia de cebado de los tejidos cerebrales humanos adultos, que se puede utilizar más adelante para experimentos posteriores.
