Este método proporciona una edición rápida y controlada de genes CRISPR-Cas9 bajo una molécula pequeña, Shield-1. También ofrece menos efectos fuera del objetivo, menor toxicidad celular y también una mayor edición de genes controlada internamente cuando se compara con la activación constitutiva de Cas9. La principal ventaja de esta partícula es que se puede utilizar para la caracterización de genes esenciales, así como genes de supervivencia tumoral.
La desestabilización de DD-Cas9 es independiente de su expresión, y esto permite que el gen de interés se coexprese bajo el mismo promotor. Este método se puede aplicar fácilmente a estudios in vivo e in vitro. Shield-1 también puede penetrar a través de la barrera hematoencefálica, lo que facilita también el estudio de genes que están involucrados en el desarrollo del cerebro.
Sembrar uniformemente células HEK293T sanas a una densidad de uno a dos millones de células por placa de cultivo de tejido de 10 centímetros mediante el uso de 10 mililitros de glucosa DMEM con FBS filtrado al 10%. Incubar las células en la incubadora de cultivo de tejidos al 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados durante 20 horas. Al día siguiente, confirme que las células alcanzaron el 70% de confluencia por microscopía de campo brillante y que están dispersas uniformemente a través de la placa.
Cambie el medio una hora antes de la transfección con un volumen final de 10 mililitros. Preparar dos tubos con 500 microlitros de medios calientes. Agregue 25 microlitros de reactivo de transfección al tubo uno e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos.
Al otro tubo, agregue una mezcla de plásmidos. Mezcle el tubo uno con el tubo dos para formar una mezcla de transfección e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Agregue la mezcla de transfección gota a gota a las células HEK293T e incube la placa en la incubadora de cultivo de tejidos.
Después de 18 horas, cambie cuidadosamente el medio a 10 mililitros de DMEM fresco con 10% FBS para eliminar el reactivo de transfección. Incubar las células durante las próximas 48 horas. Después de 48 horas, recoja el sobrenadante con una jeringa de 10 mililitros y páselo a través de un filtro de 0,45 micrómetros.
Alícuota el sobrenadante del virus y guárdalo a menos 80 grados centígrados. Para determinar el título del virus, seque 5 millones de células HEK293T por pozo en dos placas de seis pozos. Incubar ambas placas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante la noche para alcanzar una confluencia del 50 al 60%.
Al día siguiente, use una de las placas de seis pozos para contar las células en los seis pozos. Descongele la alícuota del virus que se utilizará para realizar la dilución en serie y agregue ocho microgramos por mililitro de reactivo de polibreno, prepare DMEM con 10% FBS para la dilución en serie del virus y agregue el reactivo de polibreno. Preparar dos mililitros de diluciones seriadas diez veces mayores del lentivirus de 0,1 a 0,0001 en medios que contengan polibreno.
Retire los medios de la placa de seis pozos y agregue un mililitro de diluciones virales a los pozos, dejando un pozo con medios solos como control negativo y un pozo con 100% de virus. Incubar las células durante 24 horas. Al día siguiente, retire el medio con el virus de las placas de seis pozos y cámbielo a dos mililitros de DMEM fresco con 10% FBS.
Incubar las células durante 48 a 72 horas, observando GFP con un microscopio fluorescente todos los días. Después de 48 a 72 horas, separe las células y vuelva a suuspend en un búfer máximo. Utilice un citómetro de flujo para determinar el porcentaje de expresión de GFP y calcular el título del virus utilizando la fórmula dada en el manuscrito de texto.
Placa la línea celular de interés en una placa de 10 centímetros e incubar durante la noche para alcanzar una confluencia del 50 al 60%Luego infectar las células con 500 a 2, 000 microlitros de partículas de virus en un volumen total de 10 mililitros de medio de cultivo. Incubar los medios virales durante 24 horas. Al día siguiente, cambie los medios virales a medios de cultivo y determine el porcentaje de células GFP positivas mediante citometría de flujo.
Seleccione las celdas positivas GFP utilizando BD FACSAria II para la clasificación de celdas. Expanda las celdas seleccionadas positivamente y congele el stock. Placa las células seleccionadas positivamente y las células no transducidas en placas de 12 pozos por separado, 24 horas después de la infección.
Espere hasta que las células se adhieran y cambie el medio a un medio de cultivo celular que contenga 200 nanomolares Shield-1. Reemplace el medio en las placas con células transducidas y no transducidas, dejando dos pozos por placa con medios regulares como control negativo. Incubar y extraer proteínas de cada pozo a cero, dos, seis, 12, 24, 48 y 72 horas después de agregar Shield-1 a los pozos.
Luego retire el medio con Shield-1 del resto de los pozos y cámbielo por medios celulares normales. Recolecte las proteínas de esos pozos a las dos, seis y 12 horas después de cambiar los medios. La inducción de la proteína Cas9 se confirmó por sus niveles de expresión similares entre las células transducidas y el vehículo, a pesar de la presencia o ausencia de Shield-1.
Hay suficiente inducción de la expresión de Cas9 en la línea celular transducida A549 dos horas después del tratamiento con Shield-1, que se vuelve insignificante dentro de las seis a 12 horas posteriores a la retirada de Shield-1. Las células A549 transducidas tratadas con Shield-1 disminuyeron en número después de 48 horas sin afectar la muestra de Rinella, que fue validada por inmunoblotting utilizando un anticuerpo contra la proteína RPA3 agotada. La inversión de edición de genes o mutaciones indel se confirmaron mediante ensayos de nucleasa topógrafo.
El constructo vectorial de lentivirus diseñado fue un sistema bicistrónico que llevaba otro gen de interés bajo el mismo promotor EF-1a. Se agregó una proteína fluorescente modificada, P2A, para rastrear las células infectadas. La expresión de la proteína mVenus se observó en el vehículo y en las células transducidas A549, independientemente de la expresión de DD-Cas9 y del tratamiento Shield-1.
La transducción eficiente de la línea celular con el vector DD-Cas9 es uno de los pasos limitantes de velocidad, para tener células HEK293T sanas y usar su bajo número de pasaje es crucial. La optimización de la relación entre el plásmido DD-Cas9, el plásmido de empaque y el plásmido de envoltura es muy importante para una transfección óptima. Pero además de eso, también la cantidad de Shield-1 que se necesita para estabilizar las células objetivo DD-Cas9 es algo con lo que debe tener cuidado.
El DD-Cas9 con el plásmido Cre también está disponible, y se puede utilizar para estudiar las interacciones genéticas en estudios in vivo basados en el sistema Cre-lox.
