El tejido adiposo perivascular rodea los vasos sanguíneos y regula la fisiología cardiovascular. Este protocolo se utiliza para responder preguntas clave relacionadas con la función de los progenitores adiposos humanos en el microambiente vascular. Las células progenitoras adiposas varían según su ubicación anatómica.
Mostramos que una población de progenitores multipotentes puede derivarse con éxito del tejido adiposo perivascular de pacientes con enfermedad cardiovascular. Demostrando el procedimiento estará Spencer Scott, un estudiante de medicina de mi laboratorio. Obtener una pieza de 500 miligramos de tejido adiposo perivascular humano o PVAT del quirófano como se describe en el protocolo de texto.
Transfiera PVAT humano fresco de DMEM a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de solución antibiótica. Incubar con balanceo durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Mientras el PVAT está en solución antibiótica, descongele una alícuota de tampón de disociación a 37 grados centígrados.
Añadir 50 microlitros de solución antibiótica/antimicótica 100x a cinco mililitros de tampón de disociación y esterilizar utilizando un filtro de jeringa de 0,22 micras. Añadir un mililitro de solución de gelatina a un pozo de una placa de 24 pozos. En una capucha de flujo laminar, utilice fórceps y tijeras estériles para transferir PVAT de la solución antibiótica a un plato estéril de Petri.
Agregue un mililitro de tampón de disociación precalentado al tejido. Picar finamente todo el tejido en una suspensión usando fórceps estériles y tijeras de disección. Transfiera la suspensión de un mililitro a cuatro mililitros de tampón de disociación.
Incubar el tubo de su lado en un agitador orbital de 37 grados Celsius precalgado a 200 rpm durante una hora. Después de una hora, no deben estar presentes piezas de tejido visible y la solución aparecerá como una suspensión celular turbia. Filtrar la solución a través de un colador celular de 70 micras encima de un tubo cónico de 50 mililitros.
Enjuague el colador con 10 mililitros adicionales de solución antibiótica para capturar tantas células como sea posible. No apriete el colador. Ahora pele las células durante 12 minutos a 300 veces g en una centrífuga de cubo oscilante.
Después de la centrifugación, el tubo se separará en una capa superior grasa de adipocitos, una interfase y un pellet. El pellet es la fracción vascular estromal que contiene células endoteliales, células inmunitarias, células sanguíneas y células progenitoras. Resuspender el pellet en 10 mililitros de HBSS y centrífuga durante cinco minutos a 300 veces g.
Repita este paso para un total de dos lavados en HBSS. Ahora aspira la gelatina de un plato de 24 pozos. Lave suavemente el pozo una vez con HBSS para eliminar la gelatina sin anzar.
Resuspender el pellet de fracción vascular estromal con glóbulos rojos intactos en un mililitro de medio de crecimiento y semilla sobre el pozo recubierto de gelatina. A continuación, añadir FGF2 humano a una concentración final de 25 nanogramos por mililitro en medio de cultivo. Incubar durante 24 horas a 37 grados centígrados con 5%CO2.
Después de cultivar las células durante 24 horas, retire los medios de crecimiento y lave las células cinco veces con HBSS. Este paso de lavado elimina los glóbulos rojos y las células muertas. A continuación, añadir un mililitro de medios de crecimiento fresco complementado con 25 nanogramos por mililitro FGF2 a cada pozo.
Cambie los medios cada 48 horas asegurándose de complementar con 25 nanogramos por mililitro de FGF2 fresco cada vez. Las células de paso una vez que alcanzan el 100% de confluencia de siete a 10 días después de la explanta. Para ello, aspirar medios de crecimiento y lavar la monocapa dos veces con un mililitro HBSS.
Aspirar todo el HBSS de los pozos y añadir unas gotas de solución de disociación celular. Toque y gire la placa varias veces e incubar a 37 grados Celsius con 5%CO2 durante cinco a siete minutos para levantar las células. Luego agregue aproximadamente un mililitro de medio de cultivo fresco a las células separadas.
Distribuir 500 microlitros de las células separadas a dos pozos de una placa de 24 pozos cada uno que contiene 500 microlitros de medios de crecimiento y 25 nanogramos FGF2. También, cultivo de médula ósea humana Células madre mesenquimales o colonias de MSC como se describe en el protocolo de texto. Placa el número apropiado de médula ósea y células derivadas de PVAT por pozo de una placa de 12 pozos.
Para condiciones adipogénicas y osteogénicas, placa de aproximadamente 200.000 a 225.000 células por pozo. Mientras que para condiciones condrogénicas, placa 150,000 a 175, 000 células por pozo. Luego disociar las células tanto de la población humana de células progenitoras de PVAT como de la población de MSC de médula ósea humana mediante la adición de solución de desprendimiento celular.
Incubar las células en la solución de desprendimiento a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante cinco minutos. Tire de las poblaciones en viales cónicos separados de 15 mililitros. Gire los viales hacia abajo a 500 veces g durante siete minutos para peletizar las células.
Luego resuspenda las células en un mililitro de PBS y usa un hemocitoómetro para estimar el número de célula. Plato de las celdas en platos de 12 pozos como antes. Proporcionar platos separados para las condiciones adipogénicas y osteogénicas inducidas y no inducidas.
Y añadir 1,5 mililitros de medios de conducción adipogénicos y osteogénicos a cada pozo de la condición inducida. A continuación, añadir 1,5 mililitros de medios adipogénicos y osteogénicos de no inducción a cada pozo de la condición no inducida. Comenzar la incubación de las poblaciones celulares inducidas y no inducidas adipogénicas y osteogénicas a 37 grados celsius y 5%CO2.
Gire hacia abajo el volumen restante de células progenitoras PVAT humanas y MSC de médula ósea humana durante siete minutos a 500 veces g. Determinar el volumen necesario para resuspender la médula ósea restante y los gránulos celulares derivados de PVAT para lograr una densidad de 100.000 células por cada 10 microlitros. A continuación, resuspender los pellets en el volumen calculado de medios de crecimiento MSC para la inducción de linaje condrógeno.
Mueva suavemente el volumen de las células hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta para asegurar una distribución homogénea. Ahora pipetear una gota de 10 microlitros de la solución celular concentrada en el centro de cada pozo para formar una micro masa de 100.000 células. Coloque un mililitro de agua estéril en el pozo adyacente para evitar la evaporación.
Incubar los cultivos de micro masa durante dos horas a 37 grados celsius y 5%CO2 para permitir que la micro masa se agregue. Después de dos horas, añadir cuidadosamente medios de diferenciación condrógenos con 10 nanogramos por mililitro humano TGF-beta-one a cada uno de los pozos de condición inducida. Ahora agregue cuidadosamente 1,5 mililitros de los medios sin inducción a los pozos de condición no inducidos.
Raspar o verter la micro masa en la condición condrógena inducida en un casete con el fin de deshidratar, incrustar y manchar la muestra como se describe en el protocolo de texto. Los estudios de diferenciación adipogénico se realizaron en paralelo con células progenitoras derivadas de la médula ósea humana. En la condición no inducida, no hay acumulación de lípidos es evidente.
Esto contrasta con la condición inducida que se muestra después de la tinción de lípidos neutros con aceite rojo O.Mientras que el grado de diferenciación en las células madre aórticas derivadas de PVAT es más robusto, ambas fuentes de células humanas mostraron la capacidad de diferenciar para el linaje adipogénico. El protocolo de diferenciación osteogénica se utilizó para las MSC derivadas de la médula ósea humana y las células derivadas de PVAT. Las células no inducidas no mancharon con Alizarin Red.
Después del protocolo de diferenciación osteogénica, los MSC humanos desarrollaron nódulos calcificados que se tiñeban con Alizarin Red mientras que las células PVAT aórticas humanas no lo hacían. Células derivadas de MSC de médula ósea humana y PVAT humano muestran características características de la diferenciación condrogénica con abundante acumulación de colágeno en la micro masa. La micro masa se forma a partir de MSC de médula ósea humana y células aórticas derivadas de PVAT también presentan una abundante acumulación de glicosaminoglicanos según lo indicado por la tinción azul alciano.
Morfológicamente, se detectaron estructuras similares a las lagunas con células sentadas en cavidades rodeadas de deposición de colágeno. Es fundamental picar finamente el tejido adiposo perivascular antes de la disociación enzimática y asegurar que las densidades celulares adecuadas estén chapadas para cada ensayo de diferenciación de linaje. Tras este procedimiento, se debe utilizar la PCR cuantitativa combinada con la mancha occidental y la citometría de flujo para caracterizar marcadores específicos del linaje de progenitores diferenciados de fuentes de adiposo perivascular y médula ósea.
Con esta técnica, podemos empezar a entender los mecanismos que regulan la expansión y disfunción del tejido adiposo perivascular durante la obesidad y las implicaciones que las células progenitoras tienen en la función vascular y las enfermedades cardiovasculares.
