Establecimiento de la perfusión de circuito cerrado en situ de órganos abdominales inferiores y extremidades traseras en ratones

Este protocolo se puede utilizar para responder preguntas sobre la administración de fármacos y las interacciones inmunitarias dentro de los órganos incluidos en nuestro circuito. Esta técnica permite la perfusión de órganos que no son posibles perfundirse por métodos tradicionales ex-vivo, evitando al mismo tiempo los principales órganos de aclaramiento. Antes de comenzar la cirugía, establezca un baño de agua circulante y todos los componentes con camisa de agua, a 37 grados centígrados.

Confirme que el tubo se limpia y utilice una trampa de burbujas dentro de una cámara húmeda como el depósito de perfusión para limitar el volumen de perfusión. Para realizar el procedimiento de cateterismo, confirme una falta de respuesta al reflejo del pedal, en una bombilla anestesada masculina de ocho a 10 semanas de edad ver ratón. Y coloque el ratón en la posición supina sobre una tabla de espuma de poliestireno, con la cabeza a las seis en punto.

Inmovilizar las extremidades de los animales con cinta adhesiva, y limpiar el abdomen con alcohol isopropílico. Hacer una incisión en forma de T en el abdomen, usando la coagulación electro para detener cualquier sangrado alrededor del borde de la incisión. Empuje el estómago, el yema y el colon hacia el lado derecho del abdomen, para revelar la aorta abdominal, la vena cava y las arterias y venas iliacas e iliolumbar comunes.

Bajo un microscopio de disección, localice y liga las arterias y venas ováricas e iliolumbar con suturas de seda 4-O. Lazo dos suturas de seda 4-O bajo la aorta abdominal y vena cava inferior alrededor de un centímetro por encima de la arteria ilíaca y la vena, a un milímetro de distancia. A continuación, haga un guinón suelto en la sutura más cercana a los vasos ilíacos.

Utilice un soporte de aguja para alinear y estirar horizontalmente tanto la vena cava inferior como la aorta abdominal. Y, manteniendo los vasos estirados, usa un catéter IV de escudo alado de 24 calibres para perforar la aorta abdominal. Tan pronto como la aguja penetre alrededor de un milímetro en el recipiente, presione el botón para retraer el núcleo de la aguja e inserte el catéter unos cinco milímetros en el recipiente.

Inserte un catéter de cinco milímetros en la vena cava inferior, de la misma manera. Y ata ambas suturas alrededor de los vasos cateterizados. A continuación, aplique pegamento instantáneo para inmovilizar los catéteres en el giro eréctil a, y reemplace los órganos abdominales.

Para configurar el sistema de perfusión, coloque el ratón sobre una almohadilla de silicio en la cámara húmeda con camisa de agua e inmovilice las alas del catéter a la almohadilla con agujas de calibre 19. Llene la entrada del catéter arterial, con tampón de perfusión precalentó. Utilice fórceps hemostáticos y un conector atornillado para conectar la entrada del catéter al tubo e inmovilizar el tubo de perfusión de entrada con cinta adhesiva.

Ajuste el caudal peristáltico a 0,6 mililitros por minuto, y mantenga la salida de perfusión abierta durante cinco a 10 minutos, para lavar la sangre a través del catéter venoso. Algunos coágulos estarán presentes en el catéter de salida, eliminarán los coágulos con tampón de perfusa y usarán un tornillo en el conector para fijarse al extremo del catéter venoso al tubo de salida para cerrar el circuito. A continuación, cubra la cámara húmeda con una tapa precalentada durante un máximo de dos horas de perfusión, comprobando periódicamente el nivel de perfusión.

Aquí se muestran imágenes confocales después de la perfusión con solución de timbre que contienen Hoechst 33342 y DyLight-649 lectina. El músculo, la médula ósea, los testículos, la vejiga, la próstata y la piel del pie suelen demostrar una tinción nuclear y vascular eficiente. La tinción de hematoxilina y eosina de estos tejidos después de tres horas de perfusión térmica normal, revela un lavado exitoso de los órganos, sin lesión tisular aparente.

Este modelo se puede utilizar para entender las vías de absorción de drogas, en el entorno fisiológico irrelevante. Por ejemplo, para entender el papel de los componentes séricos en la acumulación de fármacos. Estamos usando el sistema.para entender el mecanismo de acumulación de liposomas en la piel.