Normothermic Ex-Vivo Liver Machine Perfusion in Mouse. La perfusión hepática oxigenada normatérmica es una estrategia prometedora para rescatar órganos marginales y se ha introducido recientemente en la práctica clínica. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes no se comprenden bien.
Se necesita un modelo de ratón para estudiar más a fondo las vías moleculares, aprovechando los animales modificados genéticamente, como los ratones transgénicos, por lo tanto, a la espera de establecer un sistema de perfusión de máquina oxigenada normotérmica para hígados de ratón. Aquí hay un esquema de todo nuestro sistema. Primero, todo el sistema está controlado a 37 grados centígrados por un controlador termostático a través de la circulación del agua.
El perfusato es bombeado desde el depósito por una bomba peristáltica a un oxigenador. Hay un flujo de gas ininterrumpido de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono en el oxigenador. El perfusado luego pasa a través de una trampa de burbujas.
El perfusión con burbujas de aire se bombea de nuevo al depósito bajo presión. El perfusión restante fluye a la cámara del órgano donde el tubo está conectado a la vena porta. El perfusión se drena desde el hígado a través de la cava suprahepática hacia la cámara del órgano.
El flujo de salida de perfusión de la cámara del órgano se dirige de vuelta al depósito por la bomba peristáltica. Se conecta un tubo de drenaje biliar a la cámara del órgano para recoger la bilis. Esta es nuestra mesa de operaciones.
Todas las cirugías se realizan bajo un microscopio. Mantenemos condiciones de operación semi-estériles durante todo el procedimiento quirúrgico. Sostenga la cánula del tubo francés con fórceps.
Penetre la pared de la cánula con una aguja de 30G a una distancia de un centímetro desde el extremo de la cánula. Empuje la aguja a través de la cánula hasta que la punta de la aguja se haga visible. Aquí hay una imagen de comparación del catéter 26G y la cánula de fabricación propia; Ambos son adecuados para la canulación del portal del ratón.
Prepare 25 mililitros de solución salina heparinizada con una concentración final de 2, 500 unidades internacionales por mililitro, y coloque la jeringa en la incubadora fijada a 40 grados centígrados. Estos son los principales componentes del sistema de perfusión de máquina normotérmica ex-vivo. Los componentes incluyen principalmente la cámara del órgano, la máquina termostática, la bomba de rodillos, el oxigenador y el depósito.
Aquí puede ver una configuración detallada de nuestra cámara de órganos. Básicamente, se compone de un cuerpo de cámara de órgano, un sensor de presión, un intercambiador de calor y una trampa de burbujas. Instalamos una entrada de perfusión, una salida de perfusión y un puerto de drenaje biliar.
Este es el sistema de monitoreo de IDA que utilizamos para monitorear la presión de la vena porta. El sistema ADI consta de un sensor de presión, un controlador central y pantallas. Active el programa LabChart para el monitoreo de la presión.
Se requiere calibración y puesta a cero antes de cada uso del sensor de presión. Utilice mercurio de cero milímetros y mercurio de 20 milímetros como marcas para calibrar el sensor de presión para la calibración de dos pasos. Basándonos en el monitoreo constante de la presión portal, podemos ajustar el flurano portal de acuerdo con los cambios de presión.
A volúmenes iguales de perfusión al depósito y a la cámara del órgano para cebar el sistema, se debe prestar especial atención a mantener la esterilidad durante el proceso de llenado. Conecte la cámara de inducción con un enchufe de pared. Convierta el oxígeno a 0.5 litros por minuto.
Gire el isoflurano al 3%Coloque al animal en la cámara hasta que se alcance la anestesia profunda. Use una microjeringa para aplicar una dosis de analgesia adaptada al peso corporal. Aquí, siete microlitros de buprenorfina.
Ahora, comenzamos la operación de cirugía. Haga una incisión transversal en el área abdominal del ratón. La incisión en la piel se extiende a la línea axilar bilateral de la carne en ambos lados.
Haga cuidadosamente una incisión longitudinal a lo largo de la línea alba. Cortar a través de la capa muscular abdominal con electrocoagulación y tijeras. Coloque cuidadosamente un trozo de gasa húmeda para proteger el hígado de la electrocoagulación.
Exponga completamente la cavidad abdominal del ratón. Mueva cuidadosamente el intestino delgado fuera de la cavidad abdominal con un hisopo de algodón húmedo para exponer completamente el hilio. Aquí se muestra un diagrama esquemático de la canulación de la vena porta y la canulación del conducto biliar.
Básicamente, elegimos la cánula adecuada según el tamaño del ratón, y utilizamos sutura de seda 6-0 para la fijación de la cánula. Libere cuidadosamente el conducto biliar común con pinzas curvas finas sin dientes. El conducto biliar común se daña y se rompe muy fácilmente.
Una vez que se rompe, no se puede canular. Debido a la dirección de la posición anatómica, las pinzas curvas son más fáciles de operar. Coloque dos bucles de sutura de seda 6-0 sobre el conducto biliar común en preparación para el siguiente paso.
Perfore cuidadosamente el conducto biliar con una aguja de 30 G. Use pinzas curvas puntiagudas para agrandar los orificios pequeños, de modo que pueda alimentar la canulación del conducto biliar. Use pinzas de canulación de vasos a través de la cánula del conducto biliar y empújela hacia el conducto biliar. Nota.
En el momento de la canulación sentirás la resistencia traída por la bilis. Si la fuerza no está bien controlada, la cánula será empujada fuera del tracto biliar por la presión del flujo de salida de bilis. Ajuste cuidadosamente la profundidad de la cánula.
Si es demasiado profundo, puede dañar el conducto biliar, y si no es lo suficientemente profundo, puede salirse. El flujo biliar se puede observar en la cánula después de una canulación exitosa. Sujete la vena porta con fórceps planos y libere cuidadosamente el tejido conectivo con fórceps curvos.
No tire con fuerza aquí, para no causar desgarro de la vena porta. Una vez que la vena porta está dañada, es difícil recanular la vena porta. Coloque dos bucles de sutura de seda 6-0 sobre la vena porta libre.
Use un clip arterial para cerrar la vena porta distal. Perfore con mucho cuidado la vena porta con una de las cánulas de la vena porta anteriores. El flujo sanguíneo se puede observar claramente dentro de la cánula después de una punción exitosa.
Tome la solución salina de heparina precalentada de la incubadora. Retire todas las burbujas de aire. Fije la jeringa con solución salina heparinizada precalentada en la bomba de la jeringa.
Conecte el tubo de extensión de la bomba de la jeringa a la cánula de la vena porta. Ajuste la velocidad a dos mililitros por minuto y comience el enrojecimiento del hígado. Aumentar el isoflurano al 5% y sacrificar al ratón con una sobredosis de inhalación de isoflurano.
Observe el color del hígado al final del procedimiento de lavado. Extirpe el hígado una vez que el color se vuelva amarillo homogéneo. Transfiera cuidadosamente el hígado a la cámara del órgano con una placa de Petri.
Mantenga una pequeña cantidad de solución salina en la placa de Petri para evitar que se aplaste el hígado. Nota. La vena porta y el conducto biliar se pueden torcer fácilmente durante este procedimiento, lo que puede afectar la perfusión hepática y la recolección de bilis. Infunda lentamente solución salina normal en la cánula de la vena porta con una jeringa para evacuar las burbujas de aire en la cánula.
Conecte la cánula de la vena porta en el tubo de salida de perfusión en la cámara del órgano. La cánula del conducto biliar del ratón se guía a través de una válvula de la cámara del órgano, que se cierra con una tapa de goma. Luego, el tubo biliar se inserta en un microtubo de 0.5 mililitros preparado previamente con un pequeño orificio en el plomo.
Después de que todo esté conectado, encienda la bomba peristáltica. Compruebe la lectura de la presión de la vena porta para ajustar el caudal. Mantenga la presión de la vena porta entre siete y 10 milímetros de mercurio ajustando el caudal. Nota.
El caudal nominal puede variar ligeramente dependiendo de la edad y la posición de los tubos. Esta es la selección del medio de perfusión, el volumen de perfusión y la presión de perfusión basada en un estudio de la literatura de estudios de perfusión normotérmica oxigenada de la máquina hepática de rata. Esta es una prueba paso a paso para establecer el modelo de perfusión del ratón.
Se necesitaron alrededor de 14 experimentos para seleccionar los catéteres más adecuados. En nuestras manos, el uso de dos catéteres de goma francesa para la vena porta, junto con un catéter de goma francés para el conducto biliar, es la mejor combinación para lograr una perfusión homogénea con todos los catéteres en su lugar. El nivel de pH y el nivel de potasio se mantuvieron estables durante 12 horas de perfusión.
El nivel de pH varió de 7.26 a 7.71, y el nivel de potasio varió de 5.9 a 6.8 milimoles por litro. La tinción de HE muestra que después de 12 horas de perfusión, la integridad histológica del hígado de ratón estaba relativamente bien conservada. En conjunto, demostramos aquí el establecimiento exitoso de un sistema de perfusión de máquina oxigenada normotérmica para el hígado del ratón.
La perfusión de un hígado de ratón durante 12 horas resultó en una buena preservación de la morfología hepática, aunque no en todo el órgano. Se necesita un esfuerzo adicional para lograr una perfusión homogénea completa durante un período de tiempo más largo. Una vez que se logra esto, se puede considerar el uso de animales modificados genéticamente, como el uso de ratones IL-2-knockout para investigar el papel de la inflamación.
