El cultivo de callos vegetales proporciona una solución para la evaluación precisa, eficiente y rápida de la degradación metabólica de los xenobióticos en las plantas. El cultivo de callos vegetales puede excluir el microbioma o la interferencia fúngica y la degradación fotoquímica, simplificar el efecto matriz de las plantas intactas, estandarizar las condiciones de cultivo, acortar la duración del tratamiento y requerir menos esfuerzo experimental. El método aquí propuesto podría proporcionar información sobre el comportamiento de absorción y los mecanismos metabólicos de diferentes contaminantes orgánicos en los cultivos y es útil para los esfuerzos en las evaluaciones de riesgos ambientales.
Para empezar, autoclave todo el equipo y realice todas las operaciones en un banco de trabajo ultra limpio esterilizado por UV. Esterilizar la superficie vernalizada de la semilla con etanol al 75% durante 20 minutos. Enjuáguelos con agua desionizada estéril tres veces y vuelva a esterilizarlos con peróxido de hidrógeno al 20% durante 20 minutos.
Después de lavar las semillas con agua desionizada esterilizada seis veces, germinarlas asépticamente sembrando en medio Murashige y Skoog autoclave y libre de hormonas de pH 5.8 que contenga gel de agar al 1% e incubar a 26 grados centígrados con un fotoperíodo de 16 horas durante 15 días. Después de 15 días de incubación de semillas, cortar el hipocótilo y el cotiledón de la plántula en trozos pequeños de 0,5 centímetros para obtener los explantes. Transformar los explantes en una placa de Petri que contenga de 15 a 20 mililitros de medio Murashige y Skoog esterilizado en autoclave suplementado con Oxymon y Ficocianina e incubar en la oscuridad a 26 grados centígrados durante tres o cuatro semanas para inducir el callo.
Con un bisturí estéril y unas pinzas, separar el callo de aproximadamente un centímetro de diámetro formado a partir de los explantes iniciales. Para el tratamiento, disuelva 2,4-dibromofenol en 10 mililitros de líquido aséptico Murashige y medio Skoog. Luego agregue tres gramos de callo de zanahoria separado a la solución preparada de 2,4-dibromofenol.
Después de preparar el medio en el control en blanco como se describe en el manuscrito, incubar todos los matraces en la oscuridad. Para preparar la muestra, separar cuidadosamente el callo del tratamiento con 2,3-dibromofenol y controlar los matraces mediante filtración con filtros de fibra de vidrio de 0,45 micras. Lava el callo tres veces con agua ultrapura antes de recogerlo.
Liofilizar todos los callos recolectados y homogeneizar 0,2 gramos de callos secos con una trituradora de pañuelos de alto rendimiento a 70 hercios durante tres minutos. Use una microjeringa de vidrio para agregar 50 microlitros de 4-n-nanofenol deuterado sustituto en el callo y el vórtice homogeneizados durante un minuto. Añadir cinco mililitros de la solución que contiene una proporción igual de metanol y agua al callo pinchado y sonicarlo durante 30 minutos para extraer el 2,4-dibromofenol y los metabolitos.
Después de la extracción, centrifugar la suspensión a 8.000 G a cuatro grados centígrados durante 10 minutos y recoger el sobrenadante mediante pipeteo. Pasar el extracto a través de una extracción hidrofílica lipofílica en fase sólida equilibrada o un cartucho HLB-SPE con un caudal de un mililitro por minuto. Diluir los analitos pasando seis mililitros de metanol por el cartucho HLB-SPE.
A continuación, concentre el eluyente obtenido a un mililitro bajo una suave corriente de gas nitrógeno para su análisis instrumental. Para el análisis, abra la puerta del calentador de columna. A continuación, instale la columna de cromatografía líquida de ultra rendimiento conectando la entrada de la columna a la válvula de inyección y la salida a la entrada del espectrómetro de masas.
Inserte el extremo de los tubos de disolvente A y B en los frascos de disolvente correspondientes. Coloque los viales de muestra por número de serie en las ubicaciones correspondientes de las bandejas de muestras y vuelva a insertar las bandejas de muestras en la cámara de muestras. En la ventana del software, haga clic en Instrumento, luego en Método de entrada para editar las condiciones del cromatograma líquido.
Seleccione Método MS y configure los parámetros del análisis del espectro de masas. Haga clic en Archivo y luego en Nuevo para crear y nombrar la base de datos. Cargue el programa de ejemplo creado anteriormente seleccionando Archivo MS, seguido de Archivo de entrada e Inyectar volumen.
Guarde la base de datos en la carpeta de ejemplo del proyecto haciendo clic en Archivo y Guardar. A continuación, seleccione Ejecutar e iniciar en la ventana principal del software y haga clic en Adquirir datos de muestra, seguido del botón Aceptar en la lista de inicio de la ejecución de la lista de muestra para recopilar datos. Para procesar los datos, seleccione la fila de datos de destino y haga clic en la ventana del cromatograma para ver el cromatograma de MS scan.
En la ventana del cromatograma, haga clic en Pantalla, seguido de TIC. Después de hacer clic en la onda de escaneo DS, agregue el rastro y OK para obtener el escaneo de espectros de masas secundarios. El cromatograma del extracto de callo de zanahoria tratado con 2,4-dibromofenol mostró la presencia de ocho metabolitos diferentes en comparación con las muestras de control.
Además, la ausencia del pico de 2,4-dibromofenol en el cromatograma indica el rápido metabolismo del 2,4-dibromofenol en el callo de la zanahoria en condiciones experimentales. Además, el 2,4-dibromofenol incubado en el callo de zanahoria condujo a la formación de metabolitos por conjugación directa con glucosa y aminoácidos. Todos los equipos, así como el medio Murashige y Skoog, deben esterilizarse en autoclave para asegurarse de que la diferenciación y el mantenimiento del callo de la planta se realicen en condiciones asépticas.
Los enfoques ómicos que siguen este procedimiento permiten la creación de una imagen fitotóxica y mecanicista clara de los contaminantes ambientales.
