El virus del lago Tilapia es un virus emergente y patógenos contagiosos, que causan una alta mortalidad en la tilapia y sus especies híbridas. Como la tilapia es una fuente de proteínas principal para muchos países en desarrollo, la nueva infección por virus tiene un gran impacto en la acuicultura de tilapia, y también amenaza la seguridad alimentaria mundial. El desarrollo de un método rápido, preciso y sensible para detectar el virus en el tejido de los peces, ayudará a la enfermedad a controlar y reducirá el impacto del virus.
En este video, mostraremos la amplificación isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa, o ensayo RT-LAMP, para la detección rápida del virus del lago tilapia en muestras de peces. Segunda parte, extracción de ARN. En primer lugar, añadir 3250 miligramos de tejido hepático en un tubo estéril de 1,5 mililitros de microcentrífuga, que contiene 600 a 1000 microlitros ácido guanidinio-fenol base reactivo, y picar hasta que sea homogéneo.
Centrifugar a 10.000 RCF durante 30 segundos, y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Agregue un volumen igual de 95% de etanol al tubo y mezcle bien. Transfiera la solución a una columna de centrifugado, colocada en un tubo de recogida, luego centrifugar a 10.000 RCF durante 30 segundos.
Deseche el flujo y transfiera la columna a un nuevo tubo de recogida. Agregue 400 microlitros de RNA PreWash a la columna y centrifugar a 10.000 RCF durante 30 segundos. Deseche el flujo a través y repita este paso.
Agregue 700 microlitr RNA Wash Buffer en la columna y centrifugar a 10.000 RCF durante dos minutos. Después, transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. Por último, eluda el ARN en la matriz de columnas con un 100 microlitro, agua sin nucleasas y centrífuga a 10.000 RCF durante 30 segundos.
Tercera parte, diseño de imprimación. La PrimeraExplorer Versión 4 es la herramienta bioinformática más común para diseñar imprimaciones LAMP, o RT-LAMP eficientes, en las que se encuentran en su página web buenos manuales para el software. En este caso, cuatro imprimaciones específicas, compuestas por dos imprimaciones internas y dos externas, fueron diseñadas para reconocer seis regiones distintas en el segmento 3 de TiLV, originarias de Tailandia.
Después de entrar en el sitio web, donde se muestra el enlace en el vídeo, haga clic en PrimerExplorer V4. Elija el archivo que contiene la secuencia del segmento 3 de TiLV, en formato FASTA, recuperado del número al que se accede a GenBank, KX631923, o tilapia lake virus TV1 segmento 3, y luego haga clic primer Design botón. Una vez que haga clic en el botón Generar, el software se procesará, y los resultados se mostrarán. Después de optimizar las secuencias para la amplificación LAMP, en total, se seleccionó un par de imprimaciones externas, y dos pares de imprimaciones internas, para este estudio, para detectar la infección TiLV.
Este conjunto de imprimaciones se muestra aquí. Cuarta parte, demostración de RT-LAMP. La mezcla maestra para RT-LAMP específica para el virus del lago tilapia, consta de los siguientes productos químicos.
Prepare una mezcla maestra utilizando los productos químicos que se muestran en la tabla. Dispensar 22 microlitros de mezcla maestra en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros. A continuación, agregue tres microlitros de plantilla de ARN en el tubo de reacción.
Para el control negativo, utilice agua destilada en lugar de materiales de ARN, y mezcle bien. Incubar las reacciones a 65 grados centígrados durante 60 minutos, seguido de 80 grados Celsius durante 10 minutos. Después de la incubación durante 30 minutos, los cambios calorimétricos son observados visualmente por los ojos desnudos.
Cuando proceda, podemos confirmar los resultados del ensayo RT-LAMP, realizando electroforesis de gel en gel de 1,5% de agarosa, con una constante de 100 voltios, durante 40 minutos, mediante la cual se carga una escalera de ADN de tamaño molecular de un par de kilobases como marcador para determinar el tamaño del fragmento. Parte cinco, resultados representativos e interpretación. Después de la incubación durante 30 minutos, la reacción de fluorescencia de grano que sugiere la amplificación positiva de TiLV en los tejidos de peces, obviamente se observaron en muestras infectadas bajo luz UV a una longitud de onda de 365 nanómetros, mientras que las de control negativo tenían una solución clara y ligeramente incolora.
En consecuencia, se confirmó la amplificación de los productos RT-LAMP en la electroforesis de gel de agarosa, mostrando varios tamaños de las múltiples amplificaciones de repeticiones de ADN invertidas, formando estructuras de bucle de tallo bajo lámpara UV en muestras infectadas por TiLV, mientras que no se mostraron bandas en los pozos del control negativo, donde los resultados se ajustaron a los del ensayo RT-LAMP. Por lo tanto, para reducir la propagación del virus del lago tilapia, un cribado inmediato de estos peces infectados, utilizando un método de diagnóstico eficaz, es una de las claves importantes. Por lo tanto, el nuevo ensayo RT-LAMP debería ofrecer una herramienta de diagnóstico rápida y sensible que se aplicará en el proceso de medida de bioseguridad.
El ensayo podría utilizarse en el laboratorio o en las instalaciones in situ. Esperamos que el método se aplique para examinar la población de peces infectados que podría conducir a la reducción de la propagación del virus del lago tilapia.
