Nuestro protocolo nos permite cuantificar robustamente la quimiotaxis microbiana directamente en su hábitat doméstico. Y así podemos aislar microorganismos y podemos cuantificar y entender mejor el potencial metabólico. El ensayo de quimiotaxis in situ, o ISCA en resumen, es un dispositivo flexible, fácil de usar y simple que permite una nueva visión de los comportamientos microbianos y, por lo tanto, el papel y la función de los microorganismos en cualquier entorno que tenga una fase líquida.
Demostrando el procedimiento de despliegue tanto en el laboratorio como en el campo está Estelle Clerc, que actualmente es estudiante de doctorado en mi grupo de investigación. Antes de preparar el quimioatractant, filtre el medio con un filtro de 0,2 micrómetros y autoclave la solución filtrada. A continuación, prepare una solución de 10 mililitrolares de quimioatractant en 1 mililitro del medio estéril y filtre la solución quimioatractant con un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros para eliminar cualquier partícula y contaminante potencial.
A continuación, diluir la solución de quimioatractant filtrada en serie, de acuerdo con el protocolo experimental. Para llenar un ISCA, conecte una aguja de calibre 27 a una jeringa de 1 mililitro y cargue una jeringa para cada concentración del quimioatractant filtrado. Sosteniendo el dispositivo con el puerto hacia arriba, inyecte lentamente cada concentración de la sustancia en cada uno de los cinco pomos de una fila del dispositivo hasta que aparezca una pequeña gota en la parte superior de cada puerto.
Cuando todos los pozos se han llenado, transferir 1,5 mililitros del cultivo de bacterias marinas o de agua dulce de interés en 150 mililitros del medio de cultivo bacteriano apropiado. A continuación, coloque dos pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara en la superficie plana de una bandeja de 200 mililitros de capacidad. Y asegure un ISCA en cada pieza de cinta.
Con una pipeta serológica de 50 mililitros, llene lentamente la bandeja de despliegue con la solución bacteriana. Y permitir que las bacterias respondan al quimioatractant de interés durante una hora. Para finalizar el análisis, utilice una nueva pipeta de 50 mililitros para retirar suavemente el medio de la bandeja ISCA.
Para recuperar las muestras, primero coloque el ISCA de modo que el puerto mire hacia abajo. A continuación, utilice una jeringa estéril de 1 mililitro equipada con una aguja de calibre 27 para extraer la solución de cada pozo. Tirar de las muestras de cada fila de la misma concentración en un solo tubo.
Luego, analice las muestras por citometría de flujo para determinar el número de bacterias atraídas a cada concentración de quimioatractantes. Para preparar un ISCA para el despliegue en campo, primero, recoja 5 mililitros de agua por ISCA desde el lado del campo y filtre el agua a través de un filtro de jeringa de 0,2 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Pase el agua filtrada de la jeringa a través de un cartucho de filtro GP hidrófilo dos veces, recogiendo el filtrado en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros, después de cada enjuague.
A continuación, filtre el agua a través de un filtro de jeringa de 0,02 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros. Utilice alícuotas del filtrado para resuspender todos los quimioatractantes de interés a las concentraciones deseadas en tubos cónicos individuales de 15 mililitros. A continuación, utilice jeringas de 10 mililitros para filtrar los quimioatractantes resuspendidos a través de filtros individuales de jeringa de 0,2 micrómetros en tubos estériles de centrífuga cónica de 15 mililitros para eliminar cualquier partícula no deseada o compuestos insolubles de agua.
Para el despliegue en campo ISCA, atornille cada ISCA en la pieza 9 de la carcasa del dispositivo y cierre la carcasa. Selle la carcasa con cinta adhesiva y utilice cables de bungee para fijar la carcasa a un brazo de despliegue y a una estructura hecha por humanos. Alternativamente, el recinto se puede asegurar con un pequeño peso sobre un sustrato poco profundo o unido a una red en el océano Pelágico.
Sumerja completamente la carcasa para iniciar el llenado, sosteniendo el cerramiento firmemente para evitar el movimiento excesivo del agua en el interior. Una vez que el nivel del agua haya llegado a la parte superior de la carcasa, asegúrese de que no haya aire atrapado en el interior. Cuando la carcasa esté completamente llena, selle los orificios inferior y superior con dos tapones.
A continuación, deje el ISCA en su lugar durante 1 a 3 horas. Al final del período de muestreo, retire el cerramiento del agua. Coloque la carcasa sobre un recipiente para drenar el agua y retire cuidadosamente la parte superior de la cinta adhesiva de los orificios delanteros.
Una vez que la línea de agua haya pasado por debajo de la parte superior de la ISCA, retire el tapón inferior y drene el resto del agua. Mientras que los ISCA todavía están conectados a la carcasa, utilice una pipeta de 1 mililitro, o una jeringa de 1 mililitro, para eliminar cuidadosamente el agua atrapada en la parte superior de cada ISCA y retirar los ISCA sin tocar la superficie superior. A continuación, utilice una toallita desechable para extraer el líquido restante en la superficie y recupere las muestras como se ha demostrado para la recuperación de la muestra de laboratorio.
En este análisis in vitro representativo, se determinó que 1 mililolar era la concentración óptima de despliegue de glutamina, ya que inducía una respuesta quimiotáctica significativa que era 18 veces mayor que el control de agua de mar filtrada. Concentraciones más altas y más bajas de glutamina también indujo una respuesta quimiotáctica significativa, pero más débil. En este análisis de despliegue de campo, cinco réplicas de ISCA llenas de 1 glutamina milimétrica se desplegaron durante 1 hora en un sitio costero cerca de Sídney, Australia.
Y la ISCA llena de glutamina atrajo casi tres veces más bacterias que los pozos de control llenos de agua de mar filtrada. Lo más importante a recordar al desplegar el ISCA, tanto en el laboratorio como en el campo, es evitar la creación de fuertes flujos de fluidos que prevengan la quimiotaxis. Las muestras derivadas de ISCA se pueden utilizar para identificar organismos o genes específicos, para caracterizar el potencial genómico de los organismos quimiotácticos y para el aislamiento específico de cepas específicas en medios selectivos.
