La tolerancia térmica es un componente crítico de las distribuciones de especies y las respuestas al cambio climático. Aquí proporcionamos métodos para evaluar rápidamente la tolerancia al calor y al frío en pequeños insectos. Estos métodos para medir la tolerancia al frío, a través del mínimo térmico crítico y la tolerancia al calor, a través del tiempo de derribo de calor son de alto rendimiento, semiautomatados y requieren un equipo mínimo.
Demostrando el procedimiento estará David Awde, un postdoctorado de mi laboratorio. Para configurar un ensayo térmico mínimo crítico, encienda un baño de fluidos con control de temperatura y pulse el botón de reproducción para ejecutar un programa, elevando y manteniendo la temperatura del baño a 25 grados centígrados. Espere de cinco a 10 minutos para permitir que la columna del baño fluido alcance los 25 grados centígrados, antes de reemplazar el enchufe en la parte superior de la columna con un filtro de 5,08 centímetros de diámetro.
Toque aproximadamente 40 moscas de su vial de alimentos en la columna a través del embudo y reemplace rápidamente el embudo con el enchufe, teniendo cuidado de no dejar escapar a las moscas. Entonces deja que las moscas se asienten. Ocasionalmente tocando el enchufe inferior para animar a las moscas a subir.
Después de cinco minutos, presione el botón de inicio en la ganancia de baño de fluidos, para comenzar el programa de rampa de mínimo térmico crítico. Haga clic para abrir el software de grabación de pareja térmica en el ordenador y haga clic en Grabar para comenzar a registrar la temperatura dentro de la columna, cada segundo durante la duración del ensayo. Asegúrese de que cada registro de temperatura incluya la marca de tiempo específica de la segunda, de modo que los datos de temperatura se puedan combinar más adelante con los datos del monitor de embudo Drosophila.
Agregue cinco mililitros de 90% de etanol a un tubo de centrífuga cónica de 15 mililitros y coloque el tubo en un bastidor debajo de la columna. De vez en cuando, toque el tapón inferior de la columna para atraer a las moscas en la parte inferior para subir. La mayoría de las moscas estarán en una percha o cerca de la parte superior de la columna en 15 grados centígrados.
A 15 grados Celsius, coloque un embudo de vidrio de 75 milímetros de diámetro exterior en el monitor de embudo Drosophila. Retire el tapón inferior y recoja las moscas que aún estén en el enchufe del etanol. Ajuste el anillo de réplica, el monitor de embudo y el embudo, de modo que estén debajo de la columna.
Asegúrese de que el labio del embudo sella completamente la parte inferior de la columna e inserte la parte inferior del embudo en el tubo de recogida de 15 mililitros. Abra el software del monitor de embudo Drosophila. El software comenzará inmediatamente a registrar la hora y la fecha en que las moscas alcanzan su mínimo térmico crítico.
Las moscas que alcanzan su mínimo térmico crítico, perderán su función neuromuscular y caerán de sus perchas, a través del monitor de embudo Drosophila. Para monitorear si todas las moscas han alcanzado su mínimo térmico crítico, a medida que la temperatura disminuye, revise el enchufe superior y las perchas para ver si alguna mosca todavía está encaramada. Cuando todas las moscas.hayan alcanzado su mínimo térmico crítico, mueva el monitor del embudo Drosophila y se aleje de la abertura de la columna.
En raras ocasiones, las moscas pueden alcanzar su mínimo térmico crítico, pero permanecen atascadas en la columna. Abra el enchufe superior para quitar estas moscas. Para configurar un ensayo de alto rendimiento derribado por calor, utilice un aspirador y una tapa del tabique, para cargar moscas sedadas de dióxido de carbono individuales, en cada pozo de un 96 pozo modificado sin placa inferior y sellar la placa con una tapa clara y ajustada.
A continuación, coloque el plato sobre un suministro de alimentos y deje que las moscas se aclimaten al plato de 96 pozos durante al menos 48 horas. El día del ensayo, coloque la incubadora en 37,5 grados centígrados, después de 30 minutos coloque la placa de cultivo de mosca en la incubadora con la parte inferior de la placa contra el papel blanco en la parte inferior de la bandeja. Observe la orientación de los nombres de columna y fila del pozo en la bandeja y en el marco de la cámara web y coloque la cinta de color a lo largo de los lados y bordes de la placa para ayudar a verificar la orientación.
Cuando la placa esté en posición, cierre la puerta de la incubadora y haga clic en Grabar en el software de grabación de vídeo. Después de dos horas, compruebe la grabación para ver si todas las moscas, han llegado a su lugar de descanso final y han dejado de moverse. Cuando todas las moscas hayan dejado de moverse, haga clic en detener y deshacerse de las moscas.
Abra el archivo de vídeo y grabe el tiempo de derribo de cada mosca en cada pozo. La medida más consistente del calor derribó el tiempo de inactividad entre las pruebas y observaciones es el momento en que una mosca alcanza su punto de descanso final. A continuación, realice un seguimiento del vídeo en sentido inverso, centrándose en un solo pozo y observando el momento en el que la mosca se mueve primero fuera de su lugar de descanso final.
Determinar el tiempo de descanso final de cada mosca puede ser difícil. Para garantizar un análisis preciso, es importante tomarse su tiempo y observar cada pozo individualmente. En este análisis representativo, las hembras de la línea de paneles de referencia genética Drosophila, tenían temperaturas medias de mínimos térmicos significativamente más bajas que las hembras de la línea 714 de DGRP.
Además, el calor derribó el tiempo a 37,5 grados Centígrados, difieren significativamente entre las hembras de las líneas 73 y 461 DGRP. Con modificaciones menores, este método para medir el calor derribado el tiempo, podría ser utilizado para medir otros rasgos de tolerancia térmica, como el tiempo de recuperación del chill-coma o el máximo térmico crítico. Al reducir significativamente el tiempo práctico para los investigadores, estos métodos han permitido la exploración de la variación genética y los rasgos de tolerancia térmica a una escala que antes no era posible.
