Termal tolerans, tür dağılımlarının ve iklim değişikliğine tepkilerin önemli bir bileşenidir. Burada küçük böceklerde ısı ve soğuk toleransı hızla değerlendirmek için yöntemler salıyoruz. Soğuk toleransı ölçmek için kullanılan bu yöntemler, kritik termal minimum ve ısı toleransı ile, ısı devrilen zaman yoluyla yüksek üretim, yarı otomatik ve minimum ekipman gerektirir.
Prosedürü gösteren David Awde, benim laboratuvar bir postdoc olacaktır. Kritik bir termal minimum tisma kurmak için, sıcaklık kontrollü sıvı banyosu nda güç ve bir program çalıştırmak için play tuşuna basın, banyo sıcaklığını 25 santigrat dereceye yükseltip koruyun. 5,08 santimetre çapında filtre ile sütunun üst kısmındaf değiştirmeden önce, sıvı banyo sütunu 25 santigrat derece ulaşmak için izin vermek için beş ila 10 dakika bekleyin.
Huni aracılığıyla sütuniçine kendi gıda şişesinden yaklaşık 40 sinek dokunun ve hızlı bir şekilde fiş ile huni değiştirin, herhangi bir sinek kaçmasına izin vermemeye özen. O zaman sineklerin yerleşmesine izin ver. Bazen sinekleri tırmanmaya teşvik etmek için alt fişe dokunarak.
Beş dakika sonra, kritik termal minima rampa programına başlamak için sıvı banyosu kazancının başlangıç düğmesine basın. Bilgisayardaki termal çift kayıt yazılımını açmak için tıklatın ve basamak süresince her saniye sütun içindeki sıcaklığı kaydetmeye başlamak için kaydı tıklatın. Sıcaklık verilerinin daha sonra Drosophila huni monitöründeki verilerle birleştirilebilmesi için her sıcaklık kaydının ikinciye özgü zaman damgasını içerdiğinden emin olun.
15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne beş mililitre %90 etanol ekleyin ve tüpü sütunun altındaki bir rafa yerleştirin. Bazen tırmanmak için alttaki sinekleri ikna etmek için sütunun alt fişe dokunun. Sineklerin çoğu bir levrek üzerinde veya sütunun üst kısmında 15 santigrat derece olacak.
15 santigrat derecede, Drosophila huni monitörüne 75 milimetrelik dış çaptaki cam huni yerleştirin. Alt fişi çıkarın ve etanol fiş hala herhangi bir sinek toplamak. Retort halkasını, huni monitörünü ve huniyi sütunun altında olacak şekilde ayarlayın.
Huninin dudağının sütunun altını tamamen mühürlediğinden ve huninin altını 15 mililitrelik toplama tüpüne yerleştirdiğinden emin olun. Drosophila huni monitör yazılımını açın. Yazılım hemen sinekler kritik termal minima ulaşmak hangi zaman ve tarih kayıt başlayacaktır.
Kritik termal minima ulaşan sinekler, nöromüsküler fonksiyonlarını kaybedecek ve tüneklerinden düşecekler, Drosophila huni monitörü aracılığıyla. Tüm sineklerin kritik termal minima'larına ulaşıp ulaşmadığını izlemek için, sıcaklık azaldıkça, üst fişi kontrol edin ve sineklerin hala tünemiş olup olmadığını kontrol edin. Tüm sinekler, kritik termal minima ulaştığınızda, Drosophila huni monitörü hareket ettirin ve huni uzakta sütun açılış.
Nadir durumlarda, sinekler kritik termal minima ulaşabilir, ancak sütunsıkışmış kalır. Bu sinekleri çıkarmak için üst fişi açın. Yüksek üretim ısı sıcağı yıkmak için, bir aspiratör ve septum kapağı kullanın, tek tek karbondioksit yatıştırıcı sinekler yüklemek için, değiştirilmiş bir 96 iyi hiçbir alt plaka her kuyuiçine ve net bir sıkı montaj kapağı ile plaka mühür.
Sonra gıda bir kaynağı üzerine plaka yerleştirin ve sinekler en az 48 saat boyunca 96 iyi plaka için alışmak için izin verin. İnceleme günü, 30 dakika sonra tepsinin altındaki beyaz kağıt karşı plaka alt ile kuvöz içine sinek kültür plakası yerleştirin, 37,5 santigrat derece kuvöz ayarlayın. Tepsideki ve web kamerasının çerçevesine iyi sütun ve satır adlarının yönünü not edin ve yönünü doğrulamaya yardımcı olmak için plakanın kenarları na ve kenarlarına renkli bant yerleştirin.
Plaka konumlandığında, kuvöz kapısını kapatın ve video kayıt yazılımındaki kaydı tıklatın. İki saat sonra, tüm sinekler, son dinlenme noktasına ulaştı ve hareket durdu olup olmadığını görmek için kayıt kontrol edin. Tüm sinekler hareket durdu, durdurmak ve sinekler bertaraf tıklayın.
Video dosyasını açın ve her bir kuyudaki her bir sineğin nakavt süresini kaydedin. Denemeler ve gözlemler arasındaki kesinti süresini düşüren ısının en tutarlı ölçüsü, bir sineğin son dinlenme noktasına ulaştığı zamandır. Ardından videoyu tersten takip edin, tek bir kuyuya odaklanın ve sineğin son dinlenme noktasından ilk hareket ettiği zamanı belirtin.
Her sinek son dinlenme süresini belirlemek zor olabilir. Doğru bir analiz sağlamak için, zaman ayırın ve her iyi ayrı ayrı gözlemlemek önemlidir. Bu temsili analizde, Drosophila genetik referans paneli hattından gelen dişiler, DGRP hattı 714'teki dişilere göre anlamlı olarak daha düşük ortalama termal minima sıcaklıklarına sahipti.
Buna ek olarak, ısı 37,5 santigrat derece zaman aşağı devirdi, 73 ve 461 DGRP hatları gelen kadınlar arasında önemli ölçüde farklılık. Küçük değişikliklerle, devrilen ısıyı ölçmek için kullanılan bu yöntem, chill-coma geri kazanım süresi veya kritik termal maksimum gibi diğer termal tolerans özelliklerini ölçmek için kullanılabilir. Araştırmacılar için uygulamalı süreyi önemli ölçüde azaltarak, bu yöntemler genetik varyasyon ve termal tolerans özelliklerinin daha önce mümkün olmayan bir ölçekte araştırılmasına olanak sağlamıştır.
