열 내성은 종 분포와 기후 변화에 대한 대응의 중요한 구성 요소입니다. 여기서 우리는 작은 곤충의 열과 냉중성을 신속하게 평가하는 방법을 제공합니다. 중요한 열 최소 및 열 내성을 통해, 열 낙하 시간을 통해 냉차 허용 오차를 측정하는 이러한 방법은 높은 처리량, 반 자동 및 최소한의 장비가 필요합니다.
절차를 시연하는 것은 데이비드 Awde, 내 실험실에서 postdoc될 것입니다. 임계 열 최소 분석기를 설정하려면 온도 조절 유체 욕조에 전원을 공급하고 놀이 버튼을 눌러 프로그램을 실행하여 욕조의 온도를 섭씨 25도까지 올리고 유지합니다. 5~10분 정도 기다려야 유체 욕실 기둥이 섭씨 25도에 도달할 수 있도록 한 후 기둥 상단의 플러그를 5.08cm 직경 필터로 교체합니다.
음식 유리병에서 깔때기를 통해 기둥으로 약 40 마리의 파리를 누르고 깔때기를 플러그로 신속하게 교체하여 파리가 빠져나가지 않도록주의하십시오. 그런 다음 파리가 정착하도록 허용하십시오. 때때로 아래쪽 플러그를 눌러 파리가 올라가도록 격려합니다.
5분 후, 유체 목욕 게인의 시작 버튼을 눌러 중요한 열 미니마 램핑 프로그램을 시작합니다. 컴퓨터에서 열 커플 기록 소프트웨어를 열고 기록을 클릭하여 분석 기간 동안 매 초마다 열 내부의 온도를 기록하기 시작합니다. 각 온도 기록에 는 두 번째에 특정 된 타임 스탬프를 포함 하 고 온도 데이터는 나중에 Drosophila 깔때기 모니터에서 데이터와 병합될 수 있는지 확인 합니다.
15 밀리리터 원심 분리튜브에 90%에탄올5밀리리터를 넣고 튜브를 기둥 아래 랙에 놓습니다. 때때로 열의 하단 플러그를 탭하여 바닥에 있는 파리를 끌어올라 오르도록 유도합니다. 파리의 대부분은 농어또는 15도의 기둥 꼭대기 근처에 있습니다.
섭씨 15도에서 75mm 의 외부 직경 유리 깔때기를 드로소필라 깔때기 모니터에 넣습니다. 하단 플러그를 제거하고 에탄올의 플러그에 있는 파리를 수집합니다. 레토르트 링, 깔때기 모니터 및 깔때기를 조정하여 열 아래에 있도록 합니다.
깔때기의 입술이 컬럼의 바닥을 완전히 밀봉하고 깔때기의 바닥을 15 밀리리터 수집 튜브에 삽입해야 합니다. 드로소필라 깔때기 모니터 소프트웨어를 엽니다. 이 소프트웨어는 즉시 파리가 중요한 열 미니마에 도달하는 시간과 날짜를 기록하기 시작합니다.
그들의 중요 한 열 미니마에 도달 하는 파리, 그들의 신경 근육 기능을 잃고 그들의 농어에서 떨어질 것 이다, Drosophila 깔때기 모니터를 통해. 모든 파리가 중요한 열 미니마에 도달했는지 여부를 모니터링하려면 온도가 감소함에 따라 상단 플러그와 농어를 확인하여 파리가 여전히 자리 잡고 있는지 확인하십시오. 모든 파리가 중요한 열 미니마에 도달하면 드로소필라 깔때기 모니터를 이동하고 열 개구부에서 깔때기를 이동합니다.
드물게 파리는 중요한 열 미니마에 도달 할 수 있지만 열에 갇혀 있습니다. 상단 플러그를 열어 이러한 파리를 제거합니다. 높은 처리량 열을 설정하려면 분석기와 중격 뚜껑을 사용하여 개별 이산화탄소 를 96 개의 잘 수정한 96 개의 우물에 적재하고 뚜껑이 잘 고정된 뚜껑으로 플레이트를 밀봉하십시오.
그런 다음 접시를 식량 공급 위에 놓고 파리가 적어도 48 시간 동안 96 웰 플레이트에 적응할 수 있도록합니다. 분석 당일, 인큐베이터를 섭씨 37.5도로 설정하고, 30분 후에 플라이 배양판을 트레이 바닥의 백서에 대고 배양판을 인큐베이터에 넣습니다. 트레이와 웹캠 프레임의 웰 컬럼 및 행 이름의 방향을 기록하고 배의 측면과 가장자리를 따라 컬러 테이프를 배치하여 방향을 확인합니다.
플레이트가 위치에 있을 때 인큐베이터 도어를 닫고 비디오 녹화 소프트웨어에서 레코드를 클릭합니다. 2시간 후, 모든 파리가 마지막 휴식 지점에 도달하고 이동을 중지했는지 확인하기 위해 녹음을 확인하십시오. 모든 파리가 움직이지 못하면 중지를 클릭하고 파리를 폐기하십시오.
비디오 파일을 열고 각 웰에서 각 비행의 녹다운 시간을 기록합니다. 시험과 관측 사이의 가동 중지 시간을 무너뜨린 가장 일관된 측정은 비행이 마지막 휴식 지점에 도달하는 시간입니다. 그런 다음 비디오를 역으로 추적하여 단일 우물에 초점을 맞추고 플라이가 먼저 마지막 휴식 지점에서 이동하는 시간을 지적합니다.
각 비행의 마지막 휴식 시간을 결정하는 것은 어려울 수 있습니다. 정확한 분석을 위해서는 시간을 내어 개별적으로 관찰하는 것이 중요합니다. 이 대표적인 분석에서, Drosophila 유전 참조 패널 라인에서 여성은 DGRP 라인 714에서 여성보다 상당히 낮은 평균 열 미니마 온도를 했다.
또한, 열은 섭씨 37.5도에서 다운 타임을 떨어뜨렸고, 73~461DGRP 선에서 암컷 사이에 크게 차이가 있다. 사소한 수정으로, 열을 측정하는이 방법은 다운 시간을 노크, 다른 열 내성 특성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다, 이러한 냉각 혼수 상태 복구 시간 또는 중요한 열 최대와 같은. 조사자들을 위한 실습 시간을 현저히 줄임으로써, 이러한 방법은 이전에는 불가능했던 규모의 유전적 변이및 열내성 특성의 탐구를 허용했습니다.
