Este protocolo facilita la preparación y administración de un cóctel viral y de fagos contra pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación in vivo de la eficacia del fago en la contracción de la infección bacteriana. El cóctel de fagos es eficiente tanto en modelos de peces cebra de tipo salvaje como de fibrosis quística.
Abrir la posibilidad de aplicar la terapia de fagos a las infecciones bacterianas en pacientes con fibrosis quística. La terapia de phage también se puede aplicar para contrarrestar infecciones bacterianas específicas en otros sistemas modelo. Para preparar un caldo de fagos para el experimento.
Añadir 1,25 veces 10 a los séptimos fagos a un OD 600 de 0,05 P.aeruginosa cultivo a una multiplicidad de infección de uno por 10 a los tres negativos e incubar el cultivo durante tres a cuatro horas con temblor hasta que el OD 600 cae a 0.1 a 0.3. Al final de la incubación de incubación el lisato con un microgramo por mililitro de DNAse y RNAse durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Y peletiza las células por centrifugación.
Al final del filtro de centrifugación el sobrenadante a través de un diámetro de poro de 0,8 micro metros y añadir 58 gramos por litro de cloruro de sodio y 105 gramos por litro de PEG 6000. Incubar la solución a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, precipitar el fago por centrifugación.
Al final de la centrofuga eliminar el sobrenadante y disolver cuidadosamente el pellet de fago en 15 mililitros de tampón de cloruro de sodio Tris. Para purificar los fagos por gradiente de densidad de cloruro de cesio, primero estratifiquen dos mililitros de cuatro soluciones diferentes de cloruro de cesio en tubos de ultracentrífuga de poliallomertro para un rotor SW 41 y agregue 3,5 mililitros de la suspensión del fago a cada tubo. El cloruro de cesio es tóxico.
Adoptar siempre los procedimientos de seguridad adecuados al manipular y desechar este compuesto. Cuando se hayan cargado todos los tubos, coloque los tubos en el rotor teniendo cuidado de que los tubos estén equilibrados. Y centrifugar las muestras durante dos horas a 100.000 veces g y cuatro grados centígrados.
Al final de la centrifugación, utilice una jeringa con una aguja de calibre 19 para aspirar la capa blanca entre la D es igual a 1.5 y la D es igual a 1.4 regiones de densidad. Y transfiera las suspensiones a nuevos tubos de poliallomer tamaño SW 60. Centrifugar las suspensiones durante al menos 16 horas a 150.000 veces g y cuatro grados centígrados.
Y transfiera las bandas visibles a tubos de diálisis con un límite de 6.000 Dalton. A continuación, dializar las muestras recogidas dos veces contra 500 mililitros de agua durante 20 minutos por diálisis y durante la noche contra 500 mililitros de tampón de cloruro de sodio Tris. A la mañana siguiente, filtre el material de fagos resultante con un filtro de poro de 0,22 micromestros y almacene el stock en cuatro grados centígrados.
En el día de la micro inyección diluir dos soluciones de stock de morfolo morpholinos micromolar en agua estéril a una concentración final de 0,25 picomolar por embrión para obtener una solución de cinco microlitro morpho injectionlino. Y añadir 0,5 microlitros de fenol rojo a cada solución. A continuación, utilice una micropipeta de 20 microlitrotros con una punta de carga de gel fino para cargar una aguja de micro inyección con todo el volumen de solución mixta de morfolino y fije la aguja a un micro manipulador conectado a un soporte bajo un microscopio estereoreo.
Luego, con una o dos células, embriones de peces cebra dispuestos en un portaobjetos de vidrio colocado dentro de una placa Petri de 96 milímetros de diámetro, penetrar la tarea y la yema con la punta de la aguja de inyección micro e inyectar dos nanolitros de la mezcla de morlino en el embrión. A las 26 horas después de la fertilización, cargue una aguja de micro inyección con aproximadamente cinco microlitros de P.aeruginosa inoculum e inserte la aguja dorsalmente hasta el punto de partida del conducto de Cuvier en el que el conducto comienza a extenderse sobre el saco de yema. Inyectar de uno a tres nanolitros del inóculo PAO1 en el embrión asegurándose de que el volumen se expande directamente dentro del conducto y entra en la circulación.
Después de la inyección, transfiera el embrión a uno de los dos nuevos platos de Petri que contengan un medio E3 fresco complementado con fenitmiourea durante una incubación de 30 minutos o tres horas a 28 grados centígrados. A continuación, cargue una aguja de micro inyección con aproximadamente cinco microlitros del cóctel de fagos y fije la aguja al microinyector. A continuación, inyectar de uno a tres nanolitros de cóctel de fago en el conducto de Cuvier de cada embrión previamente inyectado con bacterias y colocar los embriones en uno de los dos nuevos platos de Petri que contienen un medio E3 fresco complementado con fenitmiourea a 28 grados Celsius.
A las cuatro horas después de la infección, utilice una pipeta de plástico para transferir un embrión anestesiado a un plato de fondo de vidrio. Y llene el plato con una solución de agarosa caliente de punto de fusión bajo. Cuando la agarosa esté fría, llene suavemente el plato con E3 medio complementado con solución anestésica.
Coloque el plato debajo del microscopio estéreo y utilice una punta de pipeta para colocar el embrión en la orientación deseada. A continuación, coloque el plato bajo un microscopio estéreo fluorescente con un filtro fluorescente para bacterias positivas de GFP durante un máximo de 18 horas después de la infección e imagine el embrión para la progresión de la expresión de GFP a las nueve, 14 y 18 horas después de la infección. Para determinar la carga bacteriana a las ocho horas posteriores a la infección, transfiera 15 embriones microinyecizados anestesiados a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros y reemplace la solución anestésica por 300 microlitros de 1%Triton X-100 en PBS.
Pase las agujas a través de la aguja estéril de calibre 27 de una jeringa de insulina al menos 15 veces para homogeneizar los embriones. Y preparar las diluciones en serie del homogeneato transfiriendo 100 microlitros de la mezcla resultante a 900 microlitros de PBS estériles por dilución. Para seleccionar la cepa P.aeruginosa resistente a la ampicilina natural, placa 10 microlitros de las diluciones sobre el agar LB complementado con ampicilina y incubarlos durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente cuenta el número de colonias. Permitir el cálculo del número total de unidades formadoras de colonias y el número medio de unidades formadoras de colonias por embrión infectado. Para evaluar la letalidad de la puntuación de la infección por P.aeruginosa, los embriones inyectados a las 20 horas después de la infección bajo un microscopio estéreo contando el número de embriones blancos opacos muertos.
A continuación, calcule la concentración letal media 50 dosis de P.aeruginosa que resultó en la muerte del 50% de los embriones inyectados a las 20 horas después de la infección. Para validar el fenotipo de fibrosis quística se puede evaluar la posición deteriorada de órganos internos como el hígado cardíaco y el páncreas. La carga bacteriana se reduce mediante la terapia de fagos en embriones de fibrosis quística infectados con P.Aeruginosa.
En 48 horas después de la fertilización, los embriones de fibrosis quística infectados con la bacteria P.Aeroginosa positiva de la GFP, una 30 unidades formadoras de colonias por dosis embrionaria demuestra una letalalidad del 50% a las 20 horas posteriores a la infección. La terapia de phage es igualmente eficaz a las 20 horas después de la infección cuando se administra 30 minutos o siete horas después de la inyección bacteriana. Aquí, se muestra una fibrosis quística y un embrión inyectado por P.Aeruginosa positivo A.Aeruginosa a las cuatro, nueve, 14 y 18 horas después de la infección.
Por el contrario, la fibrosis quística más P.Aeruginosa más el embrión inyectado de fago demuestra una fluorescencia reducida debido a la acción del fago contra las bacterias. La respuesta inflamatoria generada por la infección por P.aeruginosa en embriones de fibrosis quística aumenta significativamente según lo revelado por la expresión de las citoquinas proinflamatorias, TNF alfa e interleucina 1 beta después de la inyección de P.aeruginosa en comparación con el control del pez cebra inyectado. Sin embargo, la expresión de ambas citoquinas inflamatorias se reduce en los animales co-inyectados de colistos de fagos.
Los fagos deben purificarse cuidadosamente para eliminar cualquier endotoxina contaminante que pueda conservarse durante la preparación. Las preparaciones de fagos se pueden analizar mediante microscopía electrónica para evaluar la morfología del virión. Sería interesante probar si la infección en pacientes humanos por bacterias distintas de pseudomonas aeruginosa se puede curar con terapia de fagos en el modelo de peces cebra de fibrosis quística.
