Nuestra investigación se centra en comprender el papel del sistema nervioso en la progresión de la aterosclerosis. Específicamente, en cada interacción con la cresta, nuestro objetivo es responder cómo cambia el nervio durante la aterosclerosis y cómo su interacción influye en la progresión de la enfermedad. En la actualidad se utilizan varias tecnologías de vanguardia para avanzar en la investigación de la aterosclerosis con el fin de mejorar la comprensión de los mecanismos de la enfermedad.
Estos incluyen limpieza de tejidos e imágenes 3D, técnicas microscópicas avanzadas, inteligencia artificial, secuenciación de células individuales y aprendizaje automático. Durante la progresión de la aterosclerosis, los componentes de la pared arterial se someten a una reestructuración robusta. Delinear los cambios en imágenes 3D y de alta resolución de los tejidos intactos son los principales desafíos experimentales.
Las herramientas de diagnóstico por imágenes descritas aquí ayudarán a los investigadores y cardiólogos a comprender mejor la enfermedad y, finalmente, a tratar a los pacientes. El protocolo descrito aquí ofrece varias ventajas sobre las técnicas tradicionales, como la obtención de imágenes de tejidos profundos de los tejidos intactos, así como la visualización de su estructura que de otro modo sería inaccesible. Estos protocolos ayudarán a comprender mejor la interacción célula-célula y célula-tejido para mejorar la comprensión de la progresión de la enfermedad.
La visualización de los cambios celulares y estructurales en 3D en el tejido intacto puede proporcionar nuevos conocimientos para comprender mejor las preguntas biológicas sin respuesta en la investigación cardiovascular. Para comenzar, coloque el ratón anestesiado en un plato de espuma cubierto con toallas de papel quirúrgico. Fije los brazos y las piernas del ratón en posición supina con cintas adhesivas.
Desinfectar el pecho con etanol al 75%. Recoja la sangre del ventrículo izquierdo con una jeringa desechable de un mililitro. A continuación, haga una incisión en la línea media del tórax y una pequeña incisión en la aurícula derecha.
Perfundir el ventrículo izquierdo del ratón con 10 mililitros de cinco milimolares de EDTA en PBS durante cinco minutos hasta que la sangre se elimine, seguido de 20 mililitros de PBS durante 5 a 10 minutos. Finalmente, perfundir con 10 mililitros de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, extirpe los órganos internos, incluidos los órganos gastrointestinales y reproductivos.
Deje el corazón, la aorta y los riñones intactos. A continuación, retire con cuidado el timo y el tejido adiposo circundante. Exponga toda la aorta desde la aorta ascendente hasta la bifurcación ilíaca.
Cosecha toda la aorta y colócala en una placa de Petri llena de PBS. Separe la aorta en diferentes segmentos y divídala longitudinalmente para obtener dos aclaramientos de 2, 2'tiodietanol o TDE. Sujete con alfileres la aorta de la cara final en una placa plana de cera negra en forma de Y y fíjela en paraformaldehído al 4% durante la noche a cuatro grados centígrados.
Al día siguiente, desconecte la aorta y transfiérala a PBS para un lavado de cinco minutos. A continuación, transfiera la aorta a una solución de bloqueo durante dos horas para el bloqueo y la permeabilización. A continuación, incubar la aorta con anticuerpos primarios en la solución bloqueante durante 24 horas.
Lave la aorta en PBS durante cinco minutos, repitiendo cinco veces antes de incubar con anticuerpos secundarios en suero de burro normal al 10% y DAPI para la tinción nuclear durante la noche, Transfiera la aorta teñida a una concentración creciente de solución de TDE. A continuación, pegue bien el espaciador de imágenes rectangular pegajoso de doble cara a un portaobjetos de vidrio limpio y transfiera la aorta despejada, asegurándose de que la adventicia aórtica de la cara final quede frente al cubreobjetos. Monte la aorta con gotas de solución de 60% de TDE y fije con cuidado un cubreobjetos al pocillo evitando burbujas de aire.
Encienda el microscopio de escaneo láser confocal invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite 20x. Ajuste los detectores de diodos híbridos en función de los tintes de color. Ajuste la configuración de la pantalla y seleccione el formato XY de 1024 x 1024 píxeles para la creación de imágenes.
Deje caer el aceite de inmersión en el cubreobjetos y mueva el objetivo 63x bruscamente hacia la muestra hasta que toque el aceite de inmersión y el cubreobjetos. A continuación, identifique la región de interés y adquiera pilas Z del lado adventicio de la aorta de la cara final con un tamaño de paso de dos a cuatro micrómetros hasta una profundidad de 60 micrómetros para obtener imágenes tridimensionales. Asigne un nombre al archivo con los detalles de la muestra y los detalles del escaneo y guarde los datos.
Usando un microscopio multifotónico vertical equipado con un objetivo de 20x, adquiera pilas Z desde el lado abluminal en un tamaño de paso de 10 a 15 micrómetros hasta 700 micrómetros de profundidad. Después de anestesiar y perfundir al ratón con PBS y paraformaldehído, diseccione la parte del cuerpo por encima del nivel del diafragma. Fije la parte inferior del cuerpo con 4% de paraformaldehído durante uno o dos días a cuatro grados centígrados.
A continuación, lave bien la muestra en PBS durante 10 minutos, repitiendo tres veces. Incubar la muestra en solución cúbica al 20% durante 48 horas. Después de lavar con PBS, incubar la muestra en una solución de PGST durante la noche para la permeabilización y el bloqueo.
Al día siguiente, incubar la muestra con anticuerpos primarios en una solución de PGST a cuatro grados centígrados con una suave agitación durante 10 a 12 días. Después de lavar la muestra en PGST, agregue anticuerpos secundarios en DAPI en PGST a cuatro grados Celsius durante siete días. Lave bien la muestra en PGST durante una hora, repitiendo cinco veces.
Transfiera la muestra teñida a una serie de concentraciones aumentadas de soluciones de trabajo de tetrahidrofurano para la deshidratación, incubando 12 horas por concentración. Después de la deshidratación, coloque la muestra en una solución absoluta de diclorometano durante tres horas para la eliminación de lípidos. A continuación, incube la muestra en una solución de benzoato de bencilo de alcohol bencílico que coincida con el índice de refracción durante tres a seis horas.
Para comenzar, cargue las imágenes en mosaico de la pila Z de la aorta del ratón y las imágenes de la parte inferior del cuerpo en la estación de trabajo de procesamiento de imágenes. Para codificar por colores la profundidad del volumen de una celda o estructura, utilice un software de restauración de imágenes para deconvoluciar la imagen sin procesar. En el software Fiji, genere una proyección de intensidad máxima de los datos deconvoneados utilizando la codificación de colores temporal.
Cargue la serie de imágenes TIFF en mosaico Z en el software. Con el complemento de costura Fiji, cose las imágenes y guárdelas en formato TIFF. A continuación, cargue las imágenes unidas en un software de visualización tridimensional para la segmentación de imágenes.
Traza manualmente las estructuras neuronales en el eje X-Y-Z a lo largo de todo el trayecto entre la aorta y los ganglios. Cargue imágenes preprocesadas en el software de análisis de imágenes. Utilice la autofluorescencia para segmentar la aorta y los tejidos conectivos.
Aplique pseudocolores separados para visualizar la pared aórtica y la placa distintivas. Por último, utilice la función de ecualización de histograma adaptativo de contraste limitado para mejorar el contraste local sobre el fondo de las imágenes procesadas. La aorta aterosclerótica aclarada con TDE reveló células T teñidas con CD3e en placas, una neogénesis extensa de fibras nerviosas teñidas con NF200 en órganos linfoides terciarios arteriales.
Las imágenes multifotónicas de la aorta abdominal enferma en ratones knockout de APOE mostraron la aparición de axones que expresan NF200 en regiones que carecen de células B B220 positivas dentro de los órganos linfoides terciarios de las arterias. Las imágenes de lámina de luz del abdomen de ratón aclarado con iDISCO visualizaron la relación espacial entre la aorta y los ganglios simpáticos con axones recién formados teñidos con NF200 en la adventicia adyacente a la placa aterosclerótica.
