El protocolo demostrado aquí puede ayudar a dilucidar la biosíntesis de polifosfatos de inositol de las plantas y responder a preguntas sobre su papel en ciertos aspectos del metabolismo y desarrollo de la planta. Este método es altamente sensible porque el uso del precursor etiquetado radioactivamente de fosfatos de inositol permite la detección confiable de todas las especies de fosfato de inositol en las plantas. La demostración visual de este método es importante porque la mayoría de los biólogos de plantas no están familiarizados con el análisis de HPLC y la configuración necesaria.
Además, pasos críticos de este protocolo, como la extracción de fosfatos de inositol, son difíciles de seguir sin la demostración adecuada. Comience por configurar un sistema que consta de dos bombas HPLC independientes, una para el búfer A y otra para el búfer B.Ambas bombas deben ser controladas juntas a través de un ordenador o una bomba maestra. Implemente un lavado de sello de pistón para ambas bombas, ya sea a través de la fuerza gravitacional o a través de una tercera bomba de baja presión.
Conecte ambas bombas a un mezclador dinámico y, a continuación, conecte el mezclador a una válvula de inyección con un bucle de muestra que tenga al menos un mililitro de capacidad. Utilice capilares para conectar la válvula de inyección a la columna y la columna al colector de fracciones. Siembre las semillas de loto en una fila en platos cuadrados de Petri llenos de medios de crecimiento sólido que consisten en 0.8%agar bacteriológico en agua desionizada.
Permita que las semillas estratifiquen durante al menos tres días a cuatro grados centígrados en la oscuridad. Coloque las semillas en una incubadora de crecimiento. Transfiera de 10 a 20 plántulas en un pozo de una placa de cultivo de célula inferior plana de 12 pozos y clara llena con dos mililitros de solución de sal MS de media resistencia que se complementa con 1% de sacarosa y se ajusta a pH 5.7.
Añadir 45 microcurie de 3H myo-inositol a la placa y girar suavemente. Cubra la placa con una tapa y séquela con cinta quirúrgica microporosa. A continuación, vuelva a colocarlo en la incubadora de crecimiento.
Después de cinco días de etiquetado, retire las plántulas de los medios de comunicación y lávelas brevemente con agua desionizada. Secarlos con toallas de papel y transferirlos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, asegurándose de no llenar demasiado el tubo. Enganche el tubo en nitrógeno líquido y guárdelo a menos 80 grados Celsius hasta la extracción.
Tome las muestras del congelador y manténgalas en nitrógeno líquido hasta que estén listas para usar. Molerlos con un pestillo de tubo de microcentrífuga hasta que comiencen a descongelar, luego agregue 500 microlitros de tampón de extracción de frío helado. Continúe moliendo hasta que la muestra se homogeneice y la solución esté coloreada.
Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 18.000 veces G y cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera el sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Los tubos utilizados para la extracción se consideran residuos radiactivos sólidos y deben eliminarse en consecuencia.
Añadir cuidadosamente 300 microlitros de tampón de neutralización al extracto, que inmediatamente causará precipitación de proteínas y burbujeo. Después de un minuto, mezcle la muestra con una punta de pipeta y pipetee cinco microlitros en papel de pH para asegurarse de que el pH esté entre siete y ocho. Si es necesario, añada pequeñas cantidades de búfer de neutralización o tampón de extracción hasta que se alcance el pH deseado y deje que las muestras descansen sobre hielo durante al menos una hora con una tapa abierta.
A continuación, centrifugarlos durante 10 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Equipe el colector de fracción con 96 viales pequeños de centelleo y llene cada vial con dos mililitros de un cóctel de centelleo adecuado que sea compatible con tampones de pH bajo y altas concentraciones de fosfato de amonio. Encienda el sistema HPLC, luego active el lavado del sello del pistón y manténgalo activado durante todo el tramo.
Inyecte manualmente la muestra con una jeringa adecuada. Encienda las bombas y el gradiente. Mientras la ejecución de HPLC está en curso, compruebe la presión regularmente.
La presión inicial debe ser de alrededor de 18 a 24 bar y debe elevarse lentamente a 50 a 60 bar una vez que se alcanza el 100% de búfer B. Después de la carrera, cierre los viales firmemente y agite vigorosamente las fracciones con el cóctel de centelleo para mezclar. Si no procede directamente con la medición, mantenga los viales en posición vertical en la oscuridad.
Para medir las fracciones, inserte los viales en los bastidores de centelleo utilizando bastidores que se ajusten a los viales pequeños y mida cada vial durante cinco minutos en un contador de centelleo líquido. Prepare un gráfico de líneas 2D donde los recuentos medidos por minuto o CPM se tracen con respecto al tiempo de retención. Para comparar muestras entre sí, normalice los datos sumando el CPM de cada fracción eluida del minuto 25 a 96 para cada muestra individual y dividiendo el CPM total de esa muestra por el CPM total de las otras muestras.
Para realizar cuantificaciones relativas de ciertos picos de polifosfato de inositol y posteriormente crear gráficos de barras que contengan datos de replicaciones para análisis estadísticos, continúe el análisis con un software especializado que pueda calcular las áreas pico de los cromatogramas. Un espectro completo de polifosfato de inositol obtenido de extractos de A.thaliana después de contar la centelleo se muestra aquí. Los picos están muy bien separados y se pueden asignar a diferentes isómeros.
Cuando se utiliza una columna envejecida, una clara reducción de hexakisfosfato de inositol y la ausencia de pirofosfato de inositol es visible. El análisis SAX-HPLC también se realizó en plántulas de L.japonica que fueron cultivadas y etiquetadas en las mismas condiciones que las plántulas de Arabidopsis. Mientras que presumiblemente todas las especies de polifosfato de inositol y picos que se conocen de Arabidopsis se pueden ver, hay diferencias en las cantidades relativas de isómeros específicos de polifosfato de inositol entre las dos especies.
Para demostrar que las muestras no tienen que ser analizadas inmediatamente después de la extracción, una muestra se dividió en dos y la mitad de ella se analizó al día siguiente de almacenamiento a menos 80 grados centígrados. Las diferencias entre los perfiles SAX-HPLC de las muestras frescas y congeladas no fueron significativas, lo que demuestra que un ciclo de congelación-descongelación no daña la muestra y que el propio método genera resultados reproducibles. Al intentar este protocolo, siempre moler las muestras a fondo, congelado y con tampón de extracción, y apuntar a un pH cercano a neutro después de la neutralización para asegurar una recuperación máxima de fosfato de inositol radio-etiquetado para el análisis SAX-HPLC.
Es posible purificar radioetiquetado a partir de una carrera SAX-HPLC para su uso posterior, por ejemplo en reacciones mutuas mediante la recolección de fracciones sin cócteles de centelleo y la medición de sólo pequeñas alícuotas.
