O protocolo aqui demonstrado pode ajudar a elucidar a biossíntese de polifosfatos inositol das plantas e a responder perguntas sobre seu papel em certos aspectos do metabolismo e desenvolvimento das plantas. Este método é altamente sensível porque o uso do precursor radioativo de fosfatos inositol permite a detecção confiável de todas as espécies de fosfato inositol em plantas. A demonstração visual deste método é importante porque a maioria dos biólogos de plantas não está familiarizada com a análise do HPLC e a configuração necessária.
Além disso, passos críticos deste protocolo, como a extração de fosfatos inositol, são difíceis de seguir sem demonstração adequada. Comece configurando um sistema composto por duas bombas HPLC independentes, uma para buffer A e outra para buffer B.Ambas as bombas precisam ser controladas juntas através de um computador ou de uma bomba mestre. Implemente uma lavagem de vedação de pistão para ambas as bombas, seja via força gravitacional ou através de uma terceira bomba de baixa pressão.
Conecte ambas as bombas a um misturador dinâmico e conecte a batedeira a uma válvula de injeção com um laço de amostra que tenha pelo menos um mililitro de capacidade. Use capilares para conectar a válvula de injeção à coluna e à coluna ao coletor de frações. Semear sementes de lótus em uma fileira em pratos de Petri quadrados cheios de mídia de crescimento sólido consistindo de 0,8% de ágar bacteriológico em água deionizada.
Permita que as sementes estratifiquem por pelo menos três dias a quatro graus Celsius no escuro. Coloque as sementes em uma incubadora de crescimento. Transfira de 10 a 20 mudas em um poço de uma placa de cultura de célula inferior plana de 12 poços, preenchida com dois mililitros de solução de sal MS de meia resistência que é suplementada com 1%de sacarose e ajustada para pH 5.7.
Adicione 45 microcurie de 3H myo-inositol ao prato e gire-o suavemente. Cubra a placa com uma tampa e sele-a com fita cirúrgica microporosa. Em seguida, colocá-lo de volta na incubadora de crescimento.
Após cinco dias de rotulagem, remova as mudas da mídia e lave-as brevemente com água deionizada. Seque-os com toalhas de papel e transfira-as para um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro, certificando-se de não encher demais o tubo. Encaixe congelar o tubo em nitrogênio líquido e armazená-lo a menos 80 graus Celsius até a extração.
Retire as amostras do congelador e mantenha-as em nitrogênio líquido até que estejam prontas para uso. Triture-os com um pilão de tubo de microcentrifuge até que comecem a descongelar, em seguida, adicione 500 microliters de tampão de extração gelada. Continue moendo até que a amostra seja homogeneizada e a solução seja colorida.
Centrifugar as amostras por 10 minutos a 18.000 vezes G e 4 graus Celsius. Em seguida, transfira o supernasal para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Os tubos utilizados para extração são considerados resíduos radioativos sólidos e precisam ser descartados em conformidade.
Adicione cuidadosamente 300 microliters de tampão de neutralização ao extrato, o que causará imediatamente a precipitação de proteínas e borbulha. Após um minuto, misture a amostra com uma ponta de pipeta e pipeta cinco microliters no papel pH para ter certeza de que o pH está entre sete e oito. Se necessário, adicione pequenas quantidades de tampão de neutralização ou tampão de extração até que o pH desejado seja atingido e deixe as amostras descansarem no gelo por pelo menos uma hora com uma tampa aberta.
Em seguida, centrifuá-los por 10 minutos e transferir o supernante para um tubo fresco de 1,5 mililitro. Equipar o coletor de frações com 96 pequenos frascos de cintilação e encher cada frasco com dois mililitros de um coquetel de cintilação adequado que é compatível com tampões de pH baixos e altas concentrações de fosfato de amônio. Inicie o sistema HPLC e, em seguida, ative a lavagem da vedação do pistão e mantenha-a ativada durante toda a execução.
Injete manualmente a amostra com uma seringa adequada. Ligue as bombas e o gradiente. Enquanto a corrida do HPLC estiver em andamento, verifique a pressão regularmente.
A pressão inicial deve ser em torno de 18 a 24 barras e deve subir lentamente para 50 a 60 bar uma vez que 100% tampão B é atingido. Após a corrida, feche os frascos com força e vigorosamente agite as frações com o coquetel de cintilação para misturar. Se não prosseguir diretamente com a medição, mantenha os frascos em posição vertical no escuro.
Para medir as frações, insira os frascos nos racks do contador de cintilação usando racks que se encaixam nos frascos pequenos e meça cada frasco por cinco minutos em um contador de cintilação líquida. Prepare um gráfico de linha 2D onde as contagens medidas por minuto ou CPM são plotadas contra o tempo de retenção. Para comparar amostras entre si, normalize os dados somando o CPM de cada fração elucidada do minuto 25 ao 96 para cada amostra individual e dividindo o CPM total dessa amostra pelo CPM total das outras amostras.
Para realizar quantificações relativas de certos picos de polifosfato inositol e, posteriormente, criar gráficos de barras que contenham dados de replicações para análises estatísticas, continue a análise com um software especializado que possa calcular áreas de pico de cromatógramas. Um espectro completo de polifosfato inositol obtido a partir de extratos de A.thaliana após a contagem de cintilação é mostrado aqui. Os picos são bem separados e podem ser atribuídos a diferentes isômeros.
Quando uma coluna envelhecida é usada, uma clara redução do hexakisfosfato inositol e a ausência de pirofosfato inositol é visível. A análise sax-HPLC também foi realizada em mudas L.japonica que foram cultivadas e rotuladas nas mesmas condições das mudas arabidopsis. Embora presumivelmente todas as espécies de polifosfato inositol e picos conhecidos da Arabidopsis possam ser vistos, há diferenças nas quantidades relativas de isômeros de polifosfato inositol específicos entre as duas espécies.
Para demonstrar que as amostras não devem ser analisadas imediatamente após a extração, uma amostra foi dividida em duas e metade foi analisada no dia seguinte após o armazenamento a menos 80 graus Celsius. As diferenças entre os perfis SAX-HPLC das amostras frescas e congeladas não foram significativas, demonstrando que um ciclo de congelamento não prejudica a amostra e que o próprio método gera resultados reprodutíveis. Ao tentar este protocolo, triture sempre as amostras completamente, congeladas e com tampão de extração, e almeire para o pH próximo ao pH neutro após a neutralização para garantir uma recuperação máxima do fosfato inositol rotulado por rádio para análise sax-HPLC.
É possível purificar o rádio rotulado a partir de uma corrida SAX-HPLC para uso posterior, por exemplo, em reações mútuas, coletando frações sem coquetéis de cintilação e medindo apenas pequenas alíquotas.
