여기에서 입증된 프로토콜은 식물의 이노시톨 폴리인산염의 생합성을 해명하고 식물 대사 및 발달의 특정 양상에서 그들의 역할에 관하여 그들의 역할에 관하여 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 방법은 이노시톨 인산염의 방사성 표지 전구체의 사용이 식물에서 모든 이노시톨 인산염 종의 신뢰할 수있는 검출을 허용하기 때문에 매우 민감하다. 대부분의 식물 생물학자는 HPLC 분석 및 필요한 설정에 익숙하지 않으므로이 방법의 시각적 데모가 중요합니다.
또한 이노시톨 인산염 의 추출과 같은 이 프로토콜의 중요한 단계는 적절한 데모없이 따르기 어렵습니다. 먼저 버퍼 A용과 버퍼 B.Both 펌프는 컴퓨터 나 마스터 펌프를 통해 함께 제어해야 하는 두 개의 독립적인 HPLC 펌프로 구성된 시스템을 설정합니다. 중력을 통해 또는 세 번째 저압 펌프를 통해 두 펌프모두에 피스톤 씰 워시를 구현합니다.
두 펌프를 다이나믹 믹서에 연결한 다음 믹서를 사출 밸브에 연결한 다음 적어도 1밀리리터 용량의 샘플 루프를 사용하여 주입 밸브에 연결합니다. 모세혈관을 사용하여 분사 밸브를 열과 열에 분할 컬렉터에 연결합니다. 1열로 연꽃 씨앗을 뿌리는 광장 페트리 요리는 0.8%의 박테리아화 된 물에서 단단한 성장 매체로 가득합니다.
씨앗이 어둠 속에서 섭씨 4도에서 적어도 3 일 동안 계층화하도록 허용하십시오. 성장 인큐베이터에 씨앗을 배치합니다. 10~20마리의 묘목을 12웰의 투명한 평평한 바닥 세포 배양 판으로 옮기고 1%의 자당으로 보충되고 pH 5.7로 조정되는 반강도 MS 염용액의 2밀리리터로 채워집니다.
접시에 3H 묘 이노시톨 45 마이크로큐리를 넣고 부드럽게 소용돌이치십시오. 뚜껑으로 접시를 덮고 미세 다공성 수술 용 테이프로 밀봉하십시오. 그런 다음 다시 성장 인큐베이터에 넣습니다.
라벨링 5일 후, 미디어에서 모종을 제거하고 탈온된 물로 간략하게 씻습니다. 종이 타월로 건조하고 튜브를 덮어지지 않도록 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 액체 질소에 튜브를 동결 하고 추출 될 때까지 영하 80도에서 저장합니다.
냉동고에서 샘플을 가져 와서 사용할 준비가 될 때까지 액체 질소에 보관하십시오. 해동을 시작할 때까지 마이크로센트심분리기 튜브 유봉으로 갈아서 얼음 냉기 추출 버퍼 500마이크로리터를 추가합니다. 샘플이 균질화되고 용액이 착색될 때까지 계속 연삭합니다.
18, 000 배 G 및 섭씨 4도에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 그런 다음 상체를 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 추출에 사용되는 튜브는 고체 방사성 폐기물로 간주되며 그에 따라 폐기해야합니다.
조심스럽게 추출에 중화 버퍼의 300 마이크로 리터를 추가, 이는 즉시 단백질과 버블링의 강수량을 일으킬 것입니다. 1분 후 샘플을 파이펫 팁과 파이펫 5마이크로리터를 pH 용지에 섞어 pH가 7~8개 사이인지 확인합니다. 필요한 경우 원하는 pH에 도달할 때까지 소량의 중화 버퍼 또는 추출 버퍼를 추가하고 샘플을 열린 뚜껑으로 최소 한 시간 동안 얼음 위에 놓게 합니다.
그런 다음 원심 분리를 10 분 동안 분리하고 상체를 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기습니다. 분수 수집기를 96개의 작은 반짝임 바이알으로 장착하고 각 유리병을 pH 버퍼와 높은 암모늄 인산염 농도와 호환되는 적절한 섬광 칵테일 2밀리리터로 채웁니다. HPLC 시스템을 시작한 다음 피스톤 씰 세척을 활성화하고 전체 실행 중에 활성화하십시오.
시료를 적절한 주사기로 수동으로 주입합니다. 펌프와 그라데이션을 시작합니다. HPLC 실행이 진행되는 동안 정기적으로 압력을 확인하십시오.
시작 압력은 약 18에서 24 bar여야하며 100 % 버퍼 B에 도달하면 천천히 50에서 60 bar로 상승해야합니다. 달리기 후 바이알을 단단히 닫고 반짝이는 칵테일로 분수를 격렬하게 흔들어 섞습니다. 측정을 직접 진행하지 않으면 바이알을 어둠 속에서 똑바로 세워 두십시오.
분획을 측정하려면 작은 바이알에 맞는 랙을 사용하여 바이알을 반짝이 카운터 랙에 삽입하고 액체 반짝이 카운터에서 각 바이알을 5분 동안 측정합니다. 분당 측정된 카운트 또는 CPM이 보존 시간에 대해 플롯되는 2D 선 차트를 준비합니다. 샘플을 서로 비교하려면 각 개별 샘플에 대해 각 eluted 분획에서 CPM을 합산하고 해당 샘플의 총 CPM을 다른 샘플의 총 CPM으로 나누어 데이터를 정규화합니다.
특정 이노시톨 폴리포산염 피크의 상대적 정량화를 수행하고 통계 분석을 위한 복제 데이터를 포함하는 막대 그래프를 생성하기 위해 크로마토그램의 피크 영역을 계산할 수 있는 특수 소프트웨어를 사용하여 분석을 계속합니다. 신발량 계수 후 A.thaliana 추출물로부터 얻은 완전한 이노시톨 폴리인산염 스펙트럼이 여기에 나와 있다. 봉우리들은 잘 분리되어 있으며 다른 이소마에 할당할 수 있습니다.
숙성 된 컬럼을 사용하면 이노시톨 육각증염의 명확한 감소와 이노시톨 파이로포스페이트가 없는 것으로 보입니다. SAX-HPLC 분석은 또한 아라비도시스 모종과 같은 조건하에서 재배되고 표지된 L.japonica 묘목에서 수행되었습니다. 아마도 모든 이노 시 톨 폴리 인산염 종과 아라비도시스에서 알려진 피크를 볼 수 있지만, 두 종 사이의 특정 이노 시톨 폴리 인산염 이소종의 상대적 금액에 차이가 있다.
추출 직후 시료를 분석할 필요가 없다는 것을 증명하기 위해, 한 샘플은 섭씨 영하 80도에서 저장한 후 다음날 2개 반으로 분할되었다. 신선 및 냉동 시료의 SAX-HPLC 프로파일 간의 차이는 중요하지 않았으며, 하나의 동결 해동 주기가 샘플에 해를 끼치지 않으며 방법 자체가 재현 가능한 결과를 생성한다는 것을 입증했습니다. 이 프로토콜을 시도할 때는 항상 샘플을 철저히 분쇄하고, 동결및 추출 버퍼로, 중화 후 중성 pH에 가까운 것을 목표로 하여 SAX-HPLC 분석을 위한 무선 라벨이 부착된 이노시톨 인산염의 최대 복구를 보장합니다.
SAX-HPLC 실행에서 무선 라벨을 정제할 수 있으며, 예를 들어 반짝이는 칵테일없이 분수를 수집하고 작은 알리쿼트만 측정하여 상호 반응에서 사용할 수 있습니다.
