הפרוטוקול המודגם כאן יכול לעזור להחריג את הביוסינתזה של אינוזיטול פוליפוספטים של צמחים ול לענות על שאלות לגבי תפקידם בהיבטים מסוימים של חילוף החומרים וההתפתחות של הצמח. שיטה זו רגישה מאוד מכיוון שהשימוש במבשר הרדיואקטיבי של אינוזיטול פוספטים מאפשר זיהוי אמין של כל מיני הפוספט אינוזיטול בצמחים. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שרוב הביולוגים הצמחיים אינם מכירים את ניתוח HPLC ואת ההתקנה הדרושה.
בנוסף, צעדים קריטיים של פרוטוקול זה, כמו החילוץ של אינוזיטול פוספטים, קשה לעקוב ללא הדגמה נאותה. התחל בהגדרת מערכת המורכבת משתי משאבות HPLC עצמאיות, אחת עבור מאגר A ואחד עבור מאגר B.Two משאבות צריך להיות נשלט יחד באמצעות מחשב או משאבת אב. יש ליישם שטיפת חותם בוכנה עבור שתי המשאבות, בין אם באמצעות כוח כבידה או באמצעות משאבת לחץ נמוך שלישית.
חבר את שתי המשאבות למיקסר דינמי, ולאחר מכן חבר את המיקסר לשסתום הזרקה עם לולאת דגימה בעלת קיבולת מיליליטר אחת לפחות. השתמש נימים כדי לחבר את שסתום ההזרקה לעמודה ואת העמודה לאספן השבר. לזרוע זרעי לוטוס בשורה אחת על מנות פטרי מרובע מלא מדיה צמיחה מוצקה המורכבת 0.8% אגר בקטריולוגי במים deionized.
אפשר לזרעים לשכבות לפחות שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס בחושך. מניחים את הזרעים באינקובטור צמיחה. העבר 10 עד 20 שתילים לתוך באר אחת של צלחת תרבות תאים תחתונה שטוחה 12 היטב מלא שני מיליליטר של תוסף מלח MS חצי כוח כי הוא בתוספת 1% סוכרוז ומותאם pH 5.7.
מוסיפים לצלחת 45 מיקרו-קוורי של מיו-אינוזיטול 3H ומערבבים אותו בעדינות. מכסים את הצלחת במכסה ואוטמים אותה בקלטת כירורגית מיקרופורית. ואז למקם אותו בחזרה לתוך חממת הצמיחה.
לאחר חמישה ימים של תיוג, להסיר שתילים מהתקשורת ולשטוף אותם בקצרה עם מים deionized. מייבשים אותם במגבות נייר ומעבירים אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ומוודאים לא למילוי יתר של הצינור. הצמד להקפיא את הצינור בחנקן נוזלי ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד החילוץ.
קח את הדגימות מהמקפיא ולשמור אותם בחנקן נוזלי עד מוכן לשימוש. טוחנים אותם עם עלה צינור מיקרוצנטריפוגה עד שהם מתחילים להפשר, ואז מוסיפים 500 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי קר כקרח. ממשיכים לטחון עד שהדגימה הומוגנית והפתרון נצבע.
צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב 18, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. ואז להעביר את supernatant לתוך צינור טרי 1.5 מיליליטר. הצינורות המשמשים לחילוץ נחשבים לפסולת רדיואקטיבית מוצקה ויש להיפטר מהם בהתאם.
בזהירות להוסיף 300 microliters של חיץ נטרול לתמצית, אשר מיד יגרום משקעים של חלבונים מבעבע. לאחר דקה, מערבבים את המדגם עם טיפ פיפטה ופיגט חמישה מיקרוליטרים על נייר pH כדי לוודא כי ה- pH הוא בין שבע לשמונה. במידת הצורך, להוסיף כמויות קטנות של חיץ נטרול או חיץ החילוץ עד pH הרצוי הוא הגיע ולתת את הדגימות לנוח על הקרח לפחות שעה אחת עם מכסה פתוח.
ואז צנטריפוגה אותם במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לתוך צינור טרי 1.5 מיליליטר. לצייד את אספן שבר עם 96 בקבוקונים scintillation קטן ולמלא כל בקבוקון עם שני מיליליטר של קוקטייל scintillation מתאים כי הוא תואם מאגרי pH נמוכים ריכוזי אמוניום פוספט גבוה. הפעל את מערכת HPLC ולאחר מכן הפעל את שטיפה חותם הבוכנה ולשמור אותו מופעל במהלך כל הריצה.
להזריק באופן ידני את המדגם עם מזרק מתאים. הפעל את המשאבות ואת המילוי ההדרגתי. בזמן שהפעלת HPLC נמשכת, בדוק את הלחץ באופן קבוע.
הלחץ ההתחלתי צריך להיות סביב 18 עד 24 בר צריך לאט לעלות ל 50 עד 60 בר פעם 100%מאגר B הוא הגיע. לאחר הריצה, סגרו את הבקבוקונים בחוזקה ובמרץ לנער את השברים עם קוקטייל scintillation לערבב. אם לא להמשיך ישירות עם המדידה, לשמור את הבקבוקונים במצב זקוף בחושך.
כדי למדוד את השברים, הכנס את הבקבוקונים לתוך ארונות התקשורת של מונה ההיתוך באמצעות מתלים שמתאימים לבקבוקונים הקטנים ולמדוד כל בקבוקון במשך חמש דקות בדלפק תכלת נוזלי. הכן תרשים קו דו-ממדי שבו הספירות הנמדדות לדקה או CPM מותוות כנגד זמן השמירה. כדי להשוות דגימות זו עם זו, נרמל את הנתונים על-ידי סיכום העלות לאלף חשיפות מכל שבר בודד מדקה 25 עד 96 עבור כל מדגם בודד ועל-ידי חלוקת העלות לאלף חשיפות הכוללת מדגם זה לפי העלות הכוללת של הדוגמאות האחרות.
כדי לבצע כימות יחסי של פסגות פוליפוספט אינוזיטול מסוימות ולאחר מכן ליצור גרפי עמודות המכילים נתונים של שכפולים לניתוחים סטטיסטיים, להמשיך את הניתוח עם תוכנה מיוחדת שיכולה לחשב אזורי שיא של כרומטוגרמות. ספקטרום אינוזיטול פוליפוספט שלם המתקבל מתמציות A.thaliana לאחר ספירת נבלות מוצג כאן. הפסגות מופרדות יפה ו ניתן להקצות אותן לאיסומרים שונים.
כאשר נעשה שימוש בעמודה מיושנת, ניכרת הפחתה ברורה של אינוזיטול הקסאקיפוספט והיעדר אינוזיטול פירופוספט. ניתוח SAX-HPLC בוצע גם על שתילי L.japonica שגודלו ותויגו באותם תנאים כמו שתילי Arabidopsis. בעוד ככל הנראה כל מיני אינוזיטול פוליפוספט ופסגות הידועים מן Arabidopsis ניתן לראות, ישנם הבדלים בכמויות היחסיות של isomers אינוזיטול פוליפוספט ספציפי בין שני המינים.
כדי להוכיח כי אין לנתח דגימות מיד לאחר החילוץ, דגימה אחת פוצלה לשניים וחצי ממנו נותחה למחרת לאחר אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. ההבדלים בין פרופילי SAX-HPLC של הדגימות הטריות והקפאות לא היו משמעותיים, מה שמוכיח כי מחזור הפשרת הקפאה אחד אינו פוגע בדגימה וכי השיטה עצמה מייצרת תוצאות לשחזור. בעת ניסיון פרוטוקול זה, תמיד לטחון את הדגימות ביסודיות, קפוא עם מאגר החילוץ, ולכוון קרוב pH ניטרלי לאחר נטרול כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של רדיו שכותרתו אינוזיטול פוספט לניתוח SAX-HPLC.
ניתן לטהר רדיו שכותרתו מתוך SAX-HPLC לרוץ לשימוש מאוחר יותר, למשל בתגובות הדדיות על ידי איסוף שברים ללא קוקטיילים scintillation ומדידת aliquots קטן בלבד.
