Existen diferentes enfoques de cristalización para obtener cristales grandes y de alta calidad para la cristalografía de rayos X y neutrones. Uno de estos enfoques es el uso del método de diálisis. En esta técnica, la solución proteica se separa de una solución precipitante por una membrana semipermeable.
Las moléculas precipitantes se difunden a través de la membrana en la cámara de proteínas. Cuando se logra la supersaturación correcta para una nucleación espontánea, aparecerán los primeros núcleos. Aquí, demostraremos un protocolo que puede ser utilizado por OptiCrys un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio que utiliza cristalización de diálisis controlada por temperatura, y nuestros botones de micro diálisis para el cultivo de cristales de alta calidad para cristalografía macromolecular natural basada en el conocimiento del diagrama de fase de cristalización.
Para un botón de micro diálisis con cierta pipeta de volumen de microlitro 35 microlitros de solución de lisozyme en la cámara de diálisis. Este volumen adicional crea una forma ligeramente domo en la parte superior de la cámara de diálisis y evita la formación de burbujas de aire. Tome un aplicador y coloque el elástico o el anillo en su extremidad.
Coloque la membrana en la parte superior de la cámara y fijarla transfiriendo el elástico o el anillo del aplicador a la ranura del botón de diálisis. Transfiera el botón al pozo que contiene la solución de cristalización. Cubra el pozo con un resbalón de cubierta de vidrio o un trozo de cinta adhesiva.
Mantenga la muestra en 293 Kelvin en una incubadora de regulador térmico libre de vibraciones. Sabiendo que la cristalización de diálisis ofrece ventajas desde el punto de vista del crecimiento del cristal, el banco de cristalización llamado OptiCrys fue diseñado y desarrollado en nuestro laboratorio para ofrecer un control combinado totalmente automatizado de la temperatura y la composición química del experimento de cristalización biomolecular. La optimización del crecimiento del cristal por OptiCrys se basa en los diagramas de fase de concentración precipitante de temperatura.
La nucleación se produce en la zona de nucleación en las proximidades de la zona metástasis y el crecimiento del cristal tiene lugar en la zona metástasis después del diagrama de fase, hasta que la concentración de proteínas alcanza la curva de solubilidad que representa el equilibrio termodinámico entre solución y cristales. Al disminuir la temperatura en el caso de la proteína con solubilidad directa o aumentando la concentración precipitante en caso de salida de salazón, la solución de cristalización permanece en la zona metástasis y no se produce ninguna nucleación. Los cristales crecen hasta que el segundo equilibrio de solución de cristal logra y después de eso, no se observa ningún aumento adicional en el tamaño de los cristales.
Disminuir la temperatura o aumentar la concentración precipitante se repite varias veces hasta que los cristales alcanzan el tamaño deseado. Agregue la solución proteica a la cámara de diálisis del flujo controlado por temperatura, cubra la cámara de sobremesa con la membrana de diálisis y fije la membrana con el elástico o el anillo. Voltea la cámara y colóquela encima de la cámara de diálisis.
Presiónelo suave y lentamente para eliminar todo el aire atrapado entre dos piezas, fijar el depósito en su posición atornillando suavemente en la parte superior de la cámara superior. Agregue la solución de cristalización a la cámara del depósito y cúbrala con la tapa hermética. Transferir este conjunto e insertarlo en el soporte mamario del banco de cristalización OptiCrys Crystal crecimiento es un software de supervisión de la Crystallization Bench OptiCrys.
Incluye cuatro interfaces gráficas o vistas diferentes. La vista de inicio contiene botones para navegar a las otras vistas. El propósito de la interfaz de configuración es definir un escenario de experimento que se puede ejecutar automáticamente en la vista de prueba.
La última vista es la vista de mantenimiento. Para reiniciar un experimento, la vista de mantenimiento debe estar abierta donde se encuentran todos los parámetros esenciales para el funcionamiento suave de los experimentos de cristalización. Aumentar la luminosidad de la sección de luz, la luz puede aumentar de cero, sin luz a 100 brillo máximo.
Para controlar y controlar la temperatura, se utiliza la sección del regulador de temperatura. Haga clic en el botón para encenderlo. Ajuste la temperatura en la sección de punto de ajuste y pulse Intro.
Debajo de este botón, hay dos gráficos. El rojo muestra la final, la temperatura de orden y el gráfico amarillo muestra la temperatura actual. Mezclando una solución de stock, una inyección de la solución de cristalización a la cámara del depósito es controlada por la sección Palm.
Añada la concentración de la solución de stock en la primera etapa. A continuación, busque la concentración final de cada nueva solución de mero y agréguelos a la sección de concentración final. Después de pulsar el botón calcular, averiguar el volumen de la solución de stock se calculará y añadirá en el panel de volumen delante de cada panel de concentración.
Pulse el botón de preparación del lanzamiento y espere hasta que la nueva solución premier esté lista. Para intercambiar la solución de cristalización, haga clic en el botón Entrada de solución. Para detener el proceso, pulse el botón Detener distribución.
En el lado derecho de la sección del microscopio, hay varios paneles para registrar información importante de cada experimento de crecimiento de cristal. Agregue el nombre de las proteínas correspondientes, el peso molecular y la condición de cristalización en esta sección. Defina un nombre para sus experimentos simplemente escribiéndolo en el nombre de la carpeta.
En la sección imágenes nb, seleccione el número de imágenes que se deben tomar durante el experimento. Agregue el número de imágenes y, desde el panel de la derecha, elija la escala del temporizador. Haga clic en el botón de carpeta para abrir la carpeta.
En esta carpeta, hay un archivo de texto que contiene toda la información que definió anteriormente para el experimento. Las imágenes listas para cualquier tratamiento adicional también se guardan en esta carpeta. El zoom del microscopio también se puede variar automáticamente.
Cambia el zoom usando el botón más y menos en la parte superior de la sección del microscopio para aumentar o disminuir la ampliación respectivamente. Hay tres maneras diferentes de medir el tamaño del cristal. Para medir la longitud o anchura utilice el vector de anchura.
Dependiendo de la forma del cristal, se pueden elegir las herramientas específicas de la parte izquierda de la sección del microscopio. Como un polígono o un polígono. Los valores aparecerán en la sección de medida.
En el primer conjunto de experimentos, los botones de microdiálisis se sumergieron en las soluciones de cristalización con diferentes concentraciones de sal. En este sencillo experimento de cuadrícula de cristalización, la única variable es la concentración precipitante. mientras que la temperatura se mantiene constante.
Las ligeras variaciones en la concentración de sal permiten investigar el diagrama de fase de cristalización aumentando la concentración de sal de 0,7 a 1,2 aumentos de supersaturación molar y la solución en la zona de nucleación se está alejando de la zona metástasis. En consecuencia, se observa una variación en el tamaño y el número de cristales, con el número de cristales aumentando y disminuyendo su tamaño. En el primer experimento con OptiCrys bajo la condición experimental dada, una vez que el equilibrio en la cámara de diálisis alcanza, la solución de cristalización se encuentra en la zona de nucleación en las proximidades de la zona metástasis del diagrama de fase de cristalización.
Como resultado, sólo unos pocos núcleos se generan durante la primera etapa del experimento. Con el fin de mantener el crecimiento de los cristales en la zona metástasis y controlar el proceso de crecimiento del cristal, la temperatura se cambió en diferentes intervalos de tiempo. Cada vez que se completaba el equilibrio de la solución de cristal, la temperatura era variada.
Por lo tanto, la temperatura disminuyó a 291 Kelvin, 288 Kelvin y finalmente 275 Kelvin para mantener el crecimiento de cristal seleccionado en la zona metástasis. El resultado de este experimento es un solo cristal grande, con el volumen necesario para la cristalografía macromolecular natural. Los dos próximos experimentos demuestran la reversibilidad de los experimentos de diálisis controlados por temperatura para la nucleación, el crecimiento de cristales, la disolución y el crecimiento.
En el segundo experimento con OptiCrys la composición química de la solución de cristalización se mantuvo constante a través del experimento y la temperatura varió. La temperatura inicial se fijó en 291 Kelvin. Debido a la alta supersaturación, un gran número de pequeños cristales aparecieron en la cámara de cristalización.
De acuerdo con el concepto de solubilidad proteica directa, al aumentar gradualmente la temperatura a 313 Kelvin todos los cristales debían disolverse. Finalmente, al bajar la temperatura a 295 Kelvin, la segunda nucleación iniciada en las proximidades de la zona metástasis y permitió controlar el proceso de nucleación dando lugar a la formación de un menor número de núcleos. Un mayor crecimiento del cristal permitió generar la población uniforme de cristales más grandes.
En este experimento, cambiar la composición química de la solución de cristalización a temperatura constante conduce a obtener una población uniforme de cristales más grandes. La condición de cristalización era similar al experimento anterior. La disolución de los cristales se logró reduciendo gradualmente la concentración nacl de 0,9 molar a cero.
La reducción de la concentración de sal mantiene la solución en la zona subsaturada del diagrama de fase que conduce a la disolución de los cristales. A continuación, la nueva solución de cristalización con menor resistencia iónica que antes se inyectaba en la cámara del depósito. En esta concentración precipitada aparece el menor número de cristales y los cristales alcanzan un volumen mayor que antes.
Aquí proporcionamos un protocolo detallado que describe la preparación de muestras y ajusta el software de control para el cultivo de cristales grandes y de alta calidad para cristalografía macromolecular natural utilizando un instrumento totalmente automatizado desarrollado en nuestro laboratorio. Este procedimiento paso a paso fue diseñado y beneficiarse del conocimiento del diagrama de fase de cristalización con el fin de separar la nucleación y el crecimiento de cristales. Además, también se presenta un protocolo para el cultivo de cristales con patrones de microcitosis utilizando botones de macrocitosis como alternativa cuando OptiCrys no está disponible.
Además de las estrategias que mencioné para OptiCrys cambiar la composición química de la solución de cristalización y la temperatura y tomar imágenes debe hacerse manualmente. Se requiere el uso de la vibración regulada térmicamente para que la incubadora mantenga la temperatura constante, lo que es un paso crítico en la metodología demostrada.
