X선과 중성자 결정학 모두에 대해 크고 고품질의 결정을 얻기 위한 다양한 결정화 접근법이 있습니다. 이러한 방법 중 하나는 투석 방법을 사용하는 것입니다. 이 기술에서, 단백질 용액은 반 투과성 막에 의해 침전성 용액으로부터 분리된다.
침전성 분자는 단백질 챔버로 막을 가로질러 확산됩니다. 자발적인 핵형성에 대한 올바른 대체성이 달성되면 첫 번째 핵이 나타납니다. 여기에서는 온도 제어 투석 결정화를 사용하는 실험실에서 개발된 완전 자동화 기기인 OptiCrys에서 사용할 수 있는 프로토콜과 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 바탕으로 천연 거대 분자 결정예 촬영을 위한 고품질 의결을 성장시키는 마이크로 투석 버튼을 시연합니다.
특정 마이크로리터 볼륨 파이펫35 마이크로리터용 리소지메 용액이 투석실에 있는 마이크로 투석 버튼의 경우. 이 여분의 볼륨은 투석 챔버 위에 약간 돔 모양을 생성하고 기포 형성을 방지합니다. 어플리케이터를 가지고 탄성 또는 링을 극단에 놓습니다.
멤브레인을 챔버 위에 놓고 어플리케이터에서 투석 버튼의 홈으로 탄성 또는 링을 전송하여 고정합니다. 결정화 용액을 포함하는 우물로 버튼을 전송합니다. 유리 커버 슬립 또는 테이프 조각으로 우물을 덮습니다.
진동 없는 열 레귤레이터 인큐베이터에 293 켈빈에 샘플을 보관하십시오. 투석 결정화가 결정화 관점에서 이점을 제공한다는 것을 알고 결정화 벤치 소위 OptiCrys는 생체 분자 결정화 실험의 온도 및 화학 조성의 완전 자동화된 결합 된 제어를 제공하기 위해 실험실에서 설계 및 개발되었다. OptiCrys에 의한 결정 성장의 최적화는 온도 침전성 농도 위상 다이어그램을 기반으로 합니다.
핵화는 메타안정 영역 및 결정 성장 부근의 핵형성 영역에서 발생한 다음, 단백질 농도가 용액과 결정 사이의 열역학 평형을 나타내는 용해도 곡선에 도달할 때까지 위상 다이어그램 후 메타스터블 영역에서 일어난다. 직접 용해도를 가진 단백질의 경우 온도를 감소시킴으로써 또는 염질 아웃에 도달하는 경우 침전제 농도를 증가시킴으로써, 결정화 용액은 메타스터마귀 영역에 남아 핵화가 발생하지 않는다. 결정은 제 2 크리스탈 용액 평형이 달성 될 때까지 성장하고 그 후, 결정의 크기가 더 이상 증가관찰되지 않습니다.
온도를 낮추거나 침전 농도를 증가시키는 것은 결정이 원하는 크기에 도달할 때까지 여러 번 반복된다. 온도 조절 된 흐르는 설정의 투석 챔버에 단백질 용액을 추가하고 투석 막을 통해 챔버를 덮고 탄성 또는 고리로 멤브레인을 고정하십시오. 상공 챔버를 뒤집어 투석 실 위에 놓습니다.
두 조각 사이에 갇힌 모든 공기를 부드럽게 천천히 누르고, 오버 챔버 위에 부드럽게 나사로 고정하여 제자리에 있는 저장소를 고정합니다. 결정화 용액을 저수지 챔버에 추가하고 밀폐 캡으로 덮습니다. 이 어셈블리를 전송하고 결정화 벤치 OptiCrys 크리스탈 성장의 유방 지원에 삽입 결정 벤치 OptiCrys의 감독 소프트웨어입니다.
여기에는 네 가지 그래픽 인터페이스 또는 뷰가 포함됩니다. 홈 뷰에는 다른 뷰로 이동할 수 있는 버튼이 포함되어 있습니다. 설치 인터페이스의 목적은 테스트 보기에서 자동으로 실행할 수 있는 실험 시나리오를 정의하는 것입니다.
마지막 뷰는 유지 관리 보기입니다. 실험을 다시 시작하려면 결정화 실험을 원활하게 실행하기 위한 모든 필수 매개 변수가 발견되는 유지 보수 뷰를 열어야 합니다. 라이트 섹션에서 광도를 높이고 빛은 0에서 100 최대 밝기로 빛을 증가 시킬 수 있습니다.
온도를 제어하고 모니터링하기 위해 온도 조절 구역이 사용됩니다. 버튼을 클릭하여 켭니다. 세트 점 섹션의 온도를 설정하고 enter기 누릅니다.
이 단추 아래에는 두 개의 그래프가 있습니다. 빨간색 은 최종, 주문 온도 및 노란색 그래프가 현재 온도를 표시합니다. 스톡 용액을 혼합하여 결정화 용액을 저수지 챔버에 주입하여 팜 섹션에 의해 제어됩니다.
첫 번째 단계에서 스톡 솔루션의 농도를 추가합니다. 그런 다음 각 새 그루퍼 솔루션의 최종 농도를 찾아 최종 농도 섹션에 추가합니다. 계산 버튼을 누른 후, 재고 솔루션의 볼륨이 계산되고 각 농도 패널 앞의 볼륨 패널에 추가됩니다.
출시 준비 버튼을 누르고 새로운 프리미어 솔루션이 준비될 때까지 기다립니다. 결정화 솔루션 교환을 보려면 솔루션 입력 버튼을 클릭합니다. 프로세스를 중지하기 위해 배포 중지 버튼을 누릅니다.
현미경 섹션의 오른쪽에는 각 결정 성장 실험에서 중요한 정보를 기록하기위한 여러 패널이 있습니다. 이 섹션에 해당 단백질 이름, 분자량 및 결정화 상태를 추가합니다. 단순히 폴더 이름에 입력하여 실험의 이름을 정의합니다.
nb 이미지 섹션에서 실험 중에 수행해야 하는 이미지 수를 선택합니다. 이미지 의 수를 추가하고 오른쪽에있는 패널에서 타이머 규모를 선택합니다. 폴더 버튼을 클릭하여 폴더를 엽니다.
이 폴더에는 실험에 대해 이전에 정의한 모든 정보가 포함된 텍스트 파일이 있습니다. 추가 처리를 위한 준비된 이미지도 이 폴더에 저장됩니다. 현미경을 확대하면 자동으로 달라질 수도 있습니다.
현미경 섹션 위에 있는 플러스 및 마이너스 버튼을 사용하여 확대/축소를 변경하여 배율을 각각 늘리거나 줄입니다. 결정 크기를 측정하는 방법에는 세 가지가 있습니다. 길이 또는 너비를 측정하기 위해 너비 벡터를 사용합니다.
결정 형상에 따라 현미경 섹션의 왼쪽 부분에서 특정 도구를 선택할 수 있습니다. 직사각형 또는 다각형과 같은. 값이 측정값 섹션에 나타납니다.
실험의 첫 번째 세트에서, 미세 투석 버튼은 다른 염 농도와 결정화 솔루션에 침지되었다. 이 간단한 결정화 그리드 실험에서 유일한 변수는 침전성 농도입니다. 온도가 일정하게 유지되는 동안.
염 농도의 약간의 변화는 염 농도를 0.7에서 1.2까지 증가시켜 결정화 위상 다이어그램을 조사할 수 있게 해주며 핵형성 영역내의 용액이 메타안정 구역에서 멀어지고 있다. 따라서 결정수가 증가하고 크기가 감소하면서 결정의 크기와 수의 변화가 관찰됩니다. 주어진 실험 조건 하에서 OptiCrys를 가진 첫 번째 실험에서, 투석 챔버의 평형이 도달하면, 결정화 용액은 결정화 상 다이어그램의 메타안정 영역 부근의 핵형성 영역에 있다.
그 결과, 실험의 첫 번째 단계에서 는 몇 가지 핵만 생성된다. 메타안정 영역에서 결정의 성장을 유지하고 결정 성장 과정을 제어하기 위해, 온도는 다른 시간 간격으로 변경되었다. 결정용액 평형이 완성될 때마다 온도가 다양했다.
따라서 온도는 291 켈빈, 288 켈빈과 마지막으로 275 켈빈으로 감소하여 메타스터블 영역에서 선택한 결정의 성장을 유지했습니다. 이 실험의 결과는 천연 거대 분자 결정예 촬영에 필요한 부피와 함께 단일 큰 결정입니다. 다음 두 가지 실험은 핵 형성, 결정 성장, 용해 및 재성장을 위한 온도 조절 투석 실험의 가역성을 보여줍니다.
OptiCrys를 통한 두 번째 실험에서 결정화 용액의 화학 조성물은 실험을 통해 일정하게 유지되었고 온도가 다양하였다. 초기 온도는 291 켈빈으로 설정되었습니다. 높은 과포화 로 인해 결정화 챔버에 많은 수의 작은 결정이 나타났습니다.
직접 단백질 용해도의 개념에 따라, 점차적으로 온도를 313 켈빈으로 증가시킴으로써 모든 결정이 용해되었다. 마지막으로, 온도를 295켈빈으로 낮추어, 두 번째 핵은 메타안정 영역 부근에서 시작하여 핵형성 과정을 조절하여 핵의 수가 적어지는 것을 허용했다. 추가 결정 성장은 더 큰 결정의 균일 한 인구를 생성 할 수 있었습니다.
본 실험에서, 일정한 온도에서 결정화 용액의 화학 조성을 변경하면 더 큰 결정의 균일한 집단을 얻을 수 있다. 결정화 조건은 이전 실험과 유사하였다. 낙정을 용해시키는 것은 NaCl 농도를 0.9 어금니에서 0으로 점진적으로 낮추어 달성되었다.
염 농도를 줄이면 결정의 용해로 이어지는 위상 다이어그램의 저포화 영역에서 용액을 유지합니다. 그런 다음 이전보다 이온 강도가 낮은 새로운 결정화 용액이 저수지 챔버에 주입되었다. 이 침전 농도에서 낮은 수의 결정이 나타나고 결정이 이전보다 더 큰 부피에 도달합니다.
여기에서 는 실험실에서 개발된 완전 자동화 된 계측기를 사용하여 천연 거대 분자 결정학을위한 크고 고품질의 결정을 성장시키는 제어 소프트웨어를 시료 준비 및 조정하는 상세한 프로토콜을 제공했습니다. 이러한 단계별 절차는 핵형성과 결정성장을 분리하기 위해 결정화 상 다이어그램에 대한 지식으로부터 설계및 이점을 얻었다. 또한, OptiCrys를 사용할 수 없을 때 대안으로 거시성 식증 버튼을 사용하여 미세 세포증 패턴을 가진 커징 크리스탈을 위한 프로토콜도 제시됩니다.
OptiCrys에 대해 언급한 전략 외에도 결정화 용액및 온도의 화학 적 조성을 변경하고 이미지를 촬영하는 것은 수동으로 수행해야합니다. 인큐베이터에 대한 열 조절 진동을 사용하여 온도를 일정하게 유지해야 하며, 이는 방법론에서 중요한 단계입니다.
