Hay muchas personas que contribuyeron a este trabajo y la mayoría son de la membrana Caffrey Estructural y Funcional Grupo de Biología, ambos miembros pasados ​​y presentes. A todos, y especialmente a Jingquan Tan y Lyons Joseph, extendemos nuestro más sincero agradecimiento y reconocimiento. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), los Institutos Nacionales de Salud (GM75915, P50GM073210 y U54GM094599), y COST 7PM y las Acciones Marie Curie (CM0902 y PIEF GA-2009- -235.612).

1. Laboratorio Set-up Pre-cosecha <ol><li> En preparación para la cosecha, llenar la espuma seca Dewar con nitrógeno líquido y ponedlo al lado del microscopio donde la recolección se llevará a cabo. </li><li> Sumerja el disco de almacenamiento, extremo abierto hacia arriba, en el nitrógeno líquido en el interior del Dewar espuma y deje que se enfríe por completo. </li><li> Asegurar un micro-montaje de un tamaño que coincida con el cristal que se recogerá en una varita magnética (Figura 5). Es importante tener a mano un número de repuesto varitas magnéticas precargado con micro-soportes para atender situaciones en las que es necesario cosechar varios cristales de la que bolo. Varitas de repuesto deben estar disponibles en todo momento. </li><li> Colocar una micropipeta, puntas y la solución precipitante que se usó para el crecimiento de cristales junto a la cosecha microscopio. Puede ser necesaria para cubrir la mesofase y para evitar el secado cuando el bien se abre. </li><li> Tenga un cuaderno y una pluma en el banco cerca y / oabrir el ordenador. Estos serán utilizados para registrar las observaciones relativas a la calidad, aspecto, ubicación, número de almacenamiento disco, etc, de los cristales a medida que se recogen, se crio-enfriado y se colocó en almacenamiento. </li><li> Si un asistente está disponible para ayudar con la cosecha que persona debe entender claramente el protocolo que se siguió, el orden en el que los diversos pasos se llevará a cabo, y su papel en el proceso general. </li></ol> Con todos los materiales y equipos en su lugar nuestra siguiente tarea consiste en: 2. Identificar las placas y pozos que contienen cristales <ol><li> El método más simple y directa de encontrar cristales cosechables es la inspección de los pozos a mano utilizando un microscopio con normalidad y con luz polarizada cruzada. Ajuste de la intensidad de luz de iluminación del microscopio puede ayudar a localizar los cristales. </li><li> Alternativamente, un reproductor de imágenes, donde las placas se seleccionan automáticamente con normal y cruzarse polarizand luz, se puede utilizar para buscar cristales. </li><li> Valorar con ojo registra imágenes digitales en una pantalla de ordenador. </li><li> Detalle claramente los pozos con cristales para la recolección y registro de comentarios sobre el tamaño, la calidad y la ubicación de los cristales en la mesofase en el ordenador portátil o en un ordenador. </li><li> Retire la placa que contiene cristales se recogerá a partir de imágenes. </li></ol> 3. La apertura de un bien con mesofase cúbico. Método 1 Las placas en las que crecen los cristales por el método de meso son placas de vidrio de sándwich (figura 2). Con el fin de acceder a la mesofase y los cristales de su interior, es necesario abrir el pozo. Esto se hace mediante el uso de una herramienta de corte de vidrio para cortar el cubreobjetos superior que sella el pozo que puede entonces ser retirado. Existen varios enfoques para cortar y retirar el cubreobjetos de más de una cristalización bien. El uno para utilizar está dictada por la o Tipof mesofase en la que el cristal se encuentra en crecimiento. Esto puede ser la fase cúbica muy viscosa y pegajosa (Figura 3A) o su variante más fluido, la fase de esponja (Figura 3B). En este artículo de vídeo se muestra cómo abrir pozos, y para recoger los cristales de ambos materiales de alojamiento. <ol><li> Coloque el sándwich de vidrio de placa de cristalización en el escenario de un microscopio de luz. </li><li> Uso de una herramienta de corte de vidrio puntuación ligeramente el cubreobjetos con dos círculos concéntricos situados por encima del espaciador y justo fuera del perímetro del pozo. Con una herramienta de corte nueva puntuación requiere una presión mínima aplicada. Vuelva a colocar la herramienta por una nueva cuando la presión necesaria para anotar aumenta aún fraccionada, lo que suele ocurrir después de abrir 10 pozos. </li><li> Romper el vidrio en el espacio entre los dos círculos marcados con el fin de liberar el cubreobjetos interior. Esto genera gran cantidad de fragmentos de vidrio y polvo. Borrar a la basura con un hisopopapel toalla. </li><li> Eliminar el cubreobjetos liberado agarrándolo con unas pinzas de punta fina y la inclinación lejos de y fuera del pozo. En este caso, la fase cúbica permanece pegada y en su lugar sobre la placa de base del pozo. </li><li> Acerca la imagen para obtener una vista más clara de la mesofase cúbico que ya está listo para su uso en la cosecha cristal. </li></ol> 4. La apertura de un pozo con mesofase cúbico. Método 2 <ol><li> Uso de la herramienta de corte de vidrio puntuación de líneas rectas paralelas en el cubreobjetos a un lado del pozo y que se extienden a través de la misma también. Esto permite un acceso más fácil a las pinzas y la retirada del cubreobjetos. </li></ol> En esta demostración particular, el cubreobjetos grietas en liberar el cubreobjetos de la superficie del espaciador pegajoso. En el proceso, el cubreobjetos se desplaza en posición y el precipitado se separa de la fase cúbica. Cuando el cubreobjetos se levantó algunos de precipitante va con ella. Nos quedamos con un b expuestosOLUS de mesofase sin precipitante circundante. Inmediatamente, añadir 1 l precipitante fresco en la parte superior del bolo utilizando una micropipeta para evitar que la mesofase se seque y experimentando un cambio de fase que puede dañar los cristales. El bolo está ahora listo para ser usado en la recolección de cristal. 5. La apertura de un bien con la Fase Esponja. Sin éxito La fase de esponja es menos indulgente para trabajar con debido a su capacidad de flujo. Si que los resultados de flujo en la fase de esponja en contacto con el perímetro de la capilaridad y ayudarán a eliminar la mesofase y los cristales se perderá. Un ejemplo de que esto ocurra se muestra en este video clip. <ol><li> Captura de la fase esponja y alternar entre la luz polarizada normal y cruzado para localizar los cristales en la fase de esponja. </li><li> En la preparación para abrir el marcador y así cortar el cubreobjetos como se describe en la Sección 3. En el proceso, el cubreobjetos grietas. En el intento deING para abrir el bien los cambios precipitantes en la dirección de la grieta y, finalmente, entra en contacto con el espaciador. Con el precipitante en cierta fase de la esponja y de su carga de cristales que se han perdido. </li></ol> En esta secuencia particular, los polarizadores en el microscopio no está completamente cruzado y los cristales pueden ser vistas como objetos brillantes en el mismo tiempo que el pozo y su contenido permanece visible. 6. La apertura de un bien con la Fase Esponja. Con éxito <ol><li> Captura de la fase esponja e identificar un cristal, tanto en luz polarizada normal y cruzado. </li><li> Score, cortar y remover una sección de cubreobjetos cubriendo el bien, como en la sección 4.1. Luz polarizada cruzada incompleta se utiliza para realizar un seguimiento del cristal. </li><li> Introducir un trozo de papel de seda seco a través de la abertura en el cubreobjetos y en el pozo hasta que toque la solución precipitante. Wick lejos la solución de cuidadomente hasta que esté casi todo se ha ido y luego retire el tejido. Esto hace que el precipitante restante y la fase de esponja, con el cristal todavía en su lugar, para retraer bajo el cubreobjetos. </li><li> Puntuación, cortar y retirar con una pinza el resto del cubreobjetos, como en la sección 4,1. En este caso, la fase de esponja se divide; algunos restos en el pozo y se pega a algunos que el cubreobjetos. El cristal está en el bolo en el cubreobjetos. Debido a que hay presente precipitante muy poco, la fase de esponja empieza a sufrir una transición de fase probablemente debido a la desecación. Esto puede ser visto como un anillo de birrefringencia que migra hacia el centro del bolo. Añadir inmediatamente precipitante para el bolo de detener la transición. El bolo está ahora listo para su uso en la recolección de cristal. </li></ol> 7. La recolección y Cristales Cryo-enfriamiento de la fase cúbica <ol><li> Ir y venir entre la luz polarizada normal y cruzado para localizar los cristales en bolo fase cúbica en el pozo abierto. En tsu secuencia de vídeo hasta cuatro cristales birrefringentes se puede ver en las bolo fase cúbica con luz polarizada cruzada. </li><li> Utilice una. Montado crio-bucle (Figura 5) para sondear la mesofase recién expuesto para cristales, cristales para pescar y luego para sumergirlos, contenida en el crio-bucle, en nitrógeno líquido en el Dewar inmediatamente después de la cosecha Idealmente, la cosecha y el complemento de enfriamiento debería ocurrir en un movimiento continuo y rápido. Como mesofase poco nulidad aproximándose lo posible deben ser cosechados con el cristal. En nuestra experiencia, la crio-protector no se necesita con meso-cultivadas en cristales. </li><li> Dado que no es posible mirar por el cristal en la crio-bucle inmediatamente después de la cosecha inspeccionar el bolo mesofase utilizado para la recolección para verificar que el cristal ya no está allí lo que sugiere que fue extraído con éxito. </li></ol> 8. Cosecha y Cryo-enfriamiento cristales de la fase de esponja <ol><li> Ir y venir entre la luz polarizada normal y cruzado para localizar cristales en la fase de bolo esponja en el pozo abierto. En esta secuencia de vídeo de muchos cristales birrefringentes se puede ver en el bolo bajo luz polarizada cruzada. </li><li> Utilice una. Montado crio-bucle (Figura 5) para pescar cristales de la fase de esponja y para sumergirlos, contenida en o sobre el cryoloop, en nitrógeno líquido en el Dewar inmediatamente después de la cosecha Al igual que con la recolección en la fase cúbica, idealmente, el proceso de crio-enfriamiento debe suceder inmediatamente el cristal se recogieron con el menor tiempo posible transcurrido entre el evento y la cosecha real inmersión en nitrógeno líquido. Tan poco fase de adhesión esponja de lo posible deben ser cosechados con el cristal. Como se ha señalado, la crio-protector no es necesaria con en meso-crecido cristales. </li></ol> 9. Almacenamiento de cristales en Dewars <ol><li> Después de haber sumido al circuito montado en líquido nitrogen colocarlo en una de las ranuras de fijación de la pastilla de almacenamiento en el Dewar espuma. Todas las manipulaciones se realizan con el lazo, la parte superior de la varilla magnética y disco de la sumerge en nitrógeno líquido. </li><li> Anote la ubicación y los detalles de la cosechada y cristal crio-enfriado en el bloc de notas y / o en el equipo. </li><li> Cuando el disco en el Dewar espuma está llena o el día de recolección, para la transferencia se completa el disco en un soporte de disco de lado en un almacenamiento o un transporte Dewar llena con nitrógeno líquido. Los cristales pueden ser enviadas en Dewars transporte a la instalación de sincrotrón para la difracción de recolección de datos. </li></ol> 10. Los resultados representativos Los objetivos de los ejercicios de recolección y enfriamiento crio-demostrado aquí son para transferir un cristal de la mesofase de alojamiento en crio-bucles, para vitrificar el cristal de bucle y para colocarlo en el almacenamiento en nitrógeno líquido en un Dewar. La situación ideal es cuando la cosecha y la cryo-enfriamiento se realiza de tal manera que la calidad de difracción del cristal se conserva en el proceso. Como mesofase menos posible deben cosecharse con el cristal. Esto se hace para localizar el cristal y el centrado en el haz de rayos X que mucho menos difícil, para acelerar la crio-refrigeración con el fin de vitrificación, y para minimizar la dispersión de fondo de interferir la mesofase durante la recolección de datos de difracción. Algunos ejemplos de crio-refrigerados muestras en las que se puede y no el cristal puede ser visto se muestra en la Figura 6. Cuando el cristal no puede ser visto por el ojo normalmente es necesario recurrir a barrido de difracción con el fin de encontrar el cristal y centrarlo en el haz durante la recopilación de datos 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Representación esquemática de una membrana biológica que muestra la bicapa lipídica y en el que are encuentra una variedad de proteínas. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A plena carga y sellado de 96 pocillos placa de vidrio sándwich cristalización. Cada pocillo contiene 50 nl fase cúbica y una solución precipitante l. Para mayor claridad, la fase cúbica se ha manchado con el rojo Sudán y la solución precipitante incluye azul de metileno. De la referencia 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cristales de proteínas de membrana que crecen en la mesofase lipídica. Una. La fase cúbica con un cristal de la bacteriorodopsina a partir de H. halobium. B. La esponja que contiene una fase cristalina de la BtuB vitamina B12 receptor / transportista,, a partir de E. coli. De la referencia 25. Las fases cúbicas y una esponja contrastantes appearances como es evidente por la comparación de los paneles A y B. La fase cúbica en su A es extremadamente viscosa y mantiene la forma original. No fluye. Esto es particularmente evidente en los bordes de los bolo de mesofase que tienen una apariencia rugosa. Por contrato, la fase de esponja es considerablemente menos viscoso y fluye. Por lo tanto, la fase de esponja no puede retener su forma original y sus bordes son característicamente suave. Precipitantes que incluyen Jeffamine, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentanodiol, pentaeritritol propoxilato, butanodiol y hexanodiol, puede resultar en una transición de la fase cúbica a la esponja 4,26. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. El diagrama de flujo resume los pasos involucrados en la producción, cosecha y enfriamiento criogénico de meso-cultivadas en cristales de proteínas de membrana (A). Sólo los pasos rodeado por el rojo discontinuolínea, y se describe en detalle en (B), están previstas en este artículo JoVE. El panel A es de referencia 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Un vacío crio-loop montado sobre un eje que se mantiene en su lugar por una varita magnética. Expanded Vistas del pasador (A) y micro mount-(B) de esta importante herramienta para la recolección y de refrigeración criogénica se muestran. El bucle de vacío al final de la micro-montaje en B es 30 m de diámetro. Si bien no haber probado otros tipos de bucle ampliamente, nos encontramos con que la MiTeGen bucles de trabajo se muestra bien tanto con las fases cúbicas y esponja. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="La figura 6" /> Figura 6. Cosechadas y crio-enfriada de cristales de proteínas de membrana en crio-bucles según lo visto con un microscopio en línea en una línea de luz de sincrotrón. A, b. Ejemplos de cristales cosechadas (Caa3 citocromo oxidasa 34 (A), diacilglicerol quinasa, DgkA (B)), donde los cristales (flecha azul) son visibles a través de la mesofase crio-enfriado en un ejemplo de la crio-bucle. C. de donde el cristal cosechado no es visible en la mesofase crio-enfriado en un crio-bucle. La punta del bucle se identifica con una flecha roja. La adhesión crio-enfriado mesofase se identifica con una flecha azul.

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A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este artículo de vídeo demostramos cómo los cristales crecidos en una mesofase lipídica se cosechan y crio-enfriado en preparación para su uso en la recolección de datos de difracción y en última instancia para la determinación de la estructura. La mesofase de alojamiento puede ser la fase cúbica viscoso y pegajoso o la fase de esponja más fluido 4. Como las placas sándwich de vidrio se abren y cómo los cristales se cosechan mucho depende del tipo de mesofase. Por ello es importante saber cuál de los dos uno está tratando con anticipación. La identidad de los lípidos de alojamiento y el precipitante utilizado son importantes a este respecto, y la apariencia física de los bolo mesofase en la cristalización bien se puede utilizar para distinguirlos (Figura 3). La recolección de los dos tipos de mesofase se ilustra en este artículo. La recolección de pequeños cristales de una mesofase lipídico en placas intermedias de vidrio es un proceso laborioso que requiere tiempo, habilidad, experiencia, paciencia y una mano firme. Es importante dejar de lado una cantidad adecuada de tiempo para la cosecha y para establecer el laboratorio de forma que todos los suministros y equipos están a la mano de antelación. Una segunda persona para ayudar con la cosecha no es esencial, pero es recomendable. Esa persona puede ayudar con el suministro de pre-marcadas placas para el individuo que hace la recolección, así como la colocación de la crio-enfriados lazos montados con cristales recogidos en el disco de almacenamiento. El asistente también puede desempeñar un papel de apoyo importante en la documentación de las observaciones hechas en los cristales durante la cosecha que podría resultar crucial durante la recolección de datos de difracción. En ausencia de un asistente, un activada por la voz de audio de grabación de dispositivo podría ser utilizado con ventaja para la documentación. Siguiendo el protocolo descrito en este artículo le ayudará a obtener el Visor de marcha con la cosecha cristal. Sin embargo, es importante apreciar que el proceso no es sencillo y que practice se necesita antes de lanzarse a cosechar valiosos cristales de proteínas de membrana. Se recomienda por lo tanto que las placas de prueba con cristales de proteínas que no son particularmente valiosos se experimentó con primero. Esto proporcionará al neófito con una valiosa experiencia en el corte de vidrio, la eliminación de fragmentos de vidrio, levantando el cubreobjetos encima de la mesofase, usando la característica de polarización en el microscopio para observar cristales y seguirles la pista durante la cosecha y, finalmente, el manejo de los diferentes tipos de mesofases y la cosecha de los mismos. La textura de la mesofase, y por extensión la facilidad con la que los cristales pueden ser cosechadas, cambia con el tiempo durante la cristalización. Es importante por lo tanto para practicar la cosecha con cristales de menor valor, pero con los que han crecido en las mismas condiciones como las más valiosas. Es posible hacer crecer cristales de lisozima y taumatina por el método en meso o lipídica fase cúbica 28 y estos deben ser consiEred a modo de ganar familiaridad con los materiales y el método. También se debe considerar trabajar con sin proteínas mesofase primeros en aprender de sus caprichos. Los procedimientos demostrados aquí se han realizado a un cómodo 20 ° C o menos. Es posible hacer crecer cristales por el método de meso a temperaturas más bajas. Así, monooleína como el lípido de alojamiento en un estado de fase metaestable puede ser utilizado a 4 ° C 1,2,29,30. Una alternativa es utilizar el diseño racional 7,9 MAG para la cristalización a baja temperatura 31. Hacemos crysallogenesis baja temperatura de forma rutinaria con ciertas metas de proteínas de membrana. En este caso, el crecimiento de cristales y la cosecha se realiza en una cabina de refrigerador a 4 º C. Trabajar en estas condiciones tiene sus propios desafíos no menos importante de los cuales es la necesidad de atuendo cálido y confortable. El siguiente paso en el proceso global de determinación de la estructura utilizando crys macromolecularestallography es recoger datos de difracción en cristales recolectados y complemento enfriado como se demuestra en este artículo. En meso-grown cristales son generalmente pequeñas. Sin embargo, la difracción útil recogida de datos ha sido posible con los cristales que tienen una dimensión máxima de 20 micras 9. Para este propósito, micro-haz sincrotrón radiación X se usa y es el foco de un artículo JoVE separado en esta serie 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre de reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Componentes </td></tr><tr><td> Pinzas curvas </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Puntas de pipeta desechables </td><td> Gilson </td><td> Vario </td><td> Desechable </td></tr><tr><td> Espuma dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Vidrio y metal contenedores de residuos </td><td> Daniels Healthcare </td><td> DD479OL </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Bucles de cosecha </td><td> MiTeGen </td><td> Vario </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> La recolección microscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Laboratorio portátil </td><td> Vario </td><td> NA </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Empuje magnéticomuestra el botón de carga varita </td><td> Hampton Research / dimensiones moleculares </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Puck Original (para su uso con ALS estilo robots solamente) </td><td> Sistemas de Posicionamiento Crystal </td><td> CP-111-035 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Dispositivos de pipeteo </td><td> Gilson </td><td> Vario </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Soluciones precipitantes </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Sistemas de Posicionamiento Crystal </td><td> CP-111-030 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Puck Cane envío Dejado de lado (original ALS-style) con mango de gancho y la barra de bloqueo </td><td> Sistemas de Posicionamiento Crystal </td><td> CP-111-029 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> El agua purificada </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reactivo </td></tr><tr><td> Gafas ajustadas de seguridad </td><td&gt; Varios </td><td> NA </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Bases de muestra Pin - Magnetic (no cobre) </td><td> Sistemas de Posicionamiento Crystal </td><td> CP-111-015 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Envío dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Herramienta </td></tr><tr><td> Los tejidos </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Desechable </td></tr><tr><td> Carburo de tungsteno de vidrio de corte (Scriber TCT) </td><td> Herramientas Silverline (Yeovil, Reino Unido) </td><td> 633657 </td><td> Herramienta </td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

Una ruta importante para la comprensión de cómo las proteínas funcionar a un nivel mecanístico es tener la estructura de la proteína diana disponible, idealmente en la resolución atómica. Actualmente, sólo hay una manera de capturar información tal como se aplica a proteínas de membrana integral (Figura 1), y los complejos se forman, y que el método es macromolecular cristalografía de rayos X (MX). Para hacer MX cristales de calidad de difracción que se necesitan, en el caso de proteínas de membrana, no se forman fácilmente. Un método para la cristalización de proteínas de membrana que incluye el uso de mesofases lipídicas, específicamente las fases cúbicas y esponja 1-5, ha ganado considerable atención de tarde debido a los éxitos que ha tenido en el campo de receptor acoplado a proteína G 6-21 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Sin embargo, el método, en adelante referido como el método en meso o lipídica fase cúbica, viene con su propio técnicodesafíos. Éstos se producen, en parte, debido a la naturaleza generalmente viscosa y pegajosa de la mesofase lipídica en la que los cristales, que son a menudo micro-cristales, crecen. Manipular cristales se vuelve difícil como resultado y tan particularmente durante la cosecha 22,23. Los problemas se presentan también en la etapa que precede a la cosecha que requiere que las placas sándwich de vidrio en el que los cristales crecen (Figura 2) 24,25 se abre para exponer el bolo mesofase, y los cristales de la misma, para la cosecha, crio-enfriamiento y X eventuales La difracción de rayos recogida de datos. Las variantes de mesofase cúbicos y esponja (Figura 3) desde el que los cristales deben ser cosechadas tienen reologías 4,26 profundamente diferentes. La fase cúbica es viscoso y pegajoso similar a una pasta de dientes de espesor. Por el contrario, la fase de esponja es más fluida con una clara tendencia a fluir. En consecuencia, los diferentes enfoques para la apertura de pozos de cristalización containing cristales que crecen en la fase cúbica y la esponja se llaman para como de hecho se requieren diferentes métodos para la recolección de los cristales de los dos tipos de mesofase. Los protocolos para hacer precisamente eso se han ido perfeccionando y aplicado en la membrana de Biología Estructural y Funcional (MS &amp; FB) Group, y se describen en detalle en este artículo Jove (Figura 4). Se dan ejemplos de situaciones en las que los cristales son cosechadas con éxito y crio-enfriado. También proporcionamos ejemplos de casos en los que surgen problemas que conducen a la pérdida irrecuperable de cristales y describir cómo estos problemas pueden ser evitados. En este artículo se proporciona el Visor con instrucciones paso a paso para la apertura de pozos de cristalización de vidrio sándwich, para la cosecha y para la crio-enfriamiento cristales de proteínas de membrana que crecen en cúbico y en las fases de esponja.

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography at JoVE.co

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

En este documento se describen procedimientos implementados en la membrana Caffrey Estructural y Biología Grupo funcional a los cristales de la cosecha y crio cool-proteína de membrana lipídicas se cultivan en las fases cúbicas y una esponja para su uso en la determinación de estructura macromolecular usando cristalografía de rayos X.

Recolección y enfriamiento Cryo-cristales de proteínas de membrana cultivadas en mesofases lipídicas para la Determinación de la estructura por cristalografía macromolecular

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K vistas.  Trinity College Dublin. En este documento se describen procedimientos implementados en la membrana Caffrey Estructural y Biología Grupo funcional a los cristales de la cosecha y crio cool-proteína de membrana lipídicas se cultivan en las fases cúbicas y una esponja para su uso en la determinación de estructura macromolecular usando cristalografía de rayos X.

Video: Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristalización de las proteínas de membrana para la Determinación de la estructura con mesofases lipídico

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Investigación

Biología

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

La importancia de la concentración de la proteína correcta para la cinética y la determinación de afinidad en el análisis de la estructura-función

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

La evaluación de dos dimensiones ensayos de cristalización de proteínas de membrana pequeña de Estudios de Biología Estructural de Cristalografía de electrones

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristalización de proteínas de membrana en mesofases lipídico

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

De alto rendimiento de cristalización de proteínas de membrana Utilizando el Método lipídico Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

El uso de un robot para la cristalización de alto rendimiento de proteínas de membrana en mesofases lipídicas

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Microscopia intravital para formar imágenes de estructuras subcelulares en ratones vivos que expresan proteínas fluorescentes

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

La inmunodetección de la membrana externa proteínas por Citometría de Flujo de mitocondrias aisladas

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.