Существуют различные подходы к кристаллизации для получения больших и высококачественных кристаллов как для рентгеновской, так и для нейтронной кристаллографии. Одним из таких подходов является использование метода диализа. В этом методе белковый раствор отделяется от стремительного раствора полупроницаемой мембраной.
Зарождающиеся молекулы рассеиваются через мембрану в белковую камеру. Когда будет достигнута правильная супернасыщение для спонтанного нуклеации, появятся первые ядра. Здесь мы продемонстрируем протокол, который может быть использован OptiCrys полностью автоматизированным инструментом, разработанным в нашей лаборатории, который использует кристаллизацию контролируемого температурного диализа, и наши кнопки микродиа диализа для выращивания больших высококачественных кристаллов для естественной макромолекулярной кристаллографии, основанной на знании диаграммы фазы кристаллизации.
Для микро-кнопки диализа с определенным объемом микролитера пипетка 35 микролитров раствора лизозима попадает в диализную камеру. Этот дополнительный объем создает немного форму купола на верхней части камеры диализа и предотвращает образование пузырьков воздуха. Возьмите аппликатор и поместите эластичный или кольцо на конечности его.
Поместите мембрану на верхней части камеры и исправить его путем передачи эластичной или кольцо от аппликатора в паз кнопки диализа. Перенесите кнопку в колодец, содержащий раствор кристаллизации. Обложка хорошо с стеклянной крышкой скольжения или кусок ленты.
Держите образец на 293 Кельвин в вибрации свободного теплового регулятора инкубатора. Зная, что кристаллизация диализа дает преимущества с точки зрения роста кристаллизации, скамейка кристаллизации, так называемая OptiCrys, была разработана и разработана в нашей лаборатории, чтобы предложить полностью автоматизированный комбинированный контроль температуры и химического состава эксперимента по биомолекулярной кристаллизации. Оптимизация кристаллического роста OptiCrys основана на диаграммах фазы температурной фазы.
Нуклеация происходит в зоне нуклеации в непосредственной близости от метастабиальной зоны, а рост кристалла происходит в метастабиальной зоне после фазовой диаграммы, пока концентрация белка не достигнет кривой растворимости, представляющей термодинамическое равновесие между раствором и кристаллами. Снижая температуру в случае белка с прямой растворимости или увеличивая выжидательную концентрацию в случае засолки, раствор кристаллизации остается в метастабильной зоне и не происходит нуклеации. Кристаллы растут до достижения равновесия второго кристаллического раствора, после чего дальнейшего увеличения размера кристаллов не наблюдается.
Снижение температуры или повышение концентрации осадков повторяется несколько раз, пока кристаллы не достигнут желаемого размера. Добавьте белковый раствор в камеру диализа контролируемой температуры, накрываемую камерой с помощью диализной мембраны и зафиксв мембрану эластичной или кольцевой. Переверните над камерой и положить его на верхней части диализной камеры.
Нажмите его осторожно и медленно, чтобы удалить весь воздух, оказавшихся между двумя частями, исправить резервуар в его положении, аккуратно завинчивая его на верхней части над камерой. Добавьте раствор кристаллизации в камеру резервуара и накройте его герметичной крышкой. Передача этой сборки и вставил его в груди поддержку кристаллизации скамейке OptiCrys Кристалл роста является надзор программное обеспечение Кристаллизация скамейке OptiCrys.
Она включает в себя четыре различных графических интерфейсов или представлений. Домашнее представление содержит кнопки для навигации по другим представлениям. Целью интерфейса настройки является определение сценария эксперимента, который может быть запущен автоматически в тестовом представлении.
Последним представлением является представление обслуживания. Чтобы перезапустить эксперимент, представление обслуживания должно быть открытым, где находятся все необходимые параметры для плавного запуска экспериментов по кристаллизации. Увеличьте светимость от световой секции, свет может увеличиться с нуля, без света до 100 максимальной яркости.
Для контроля и мониторинга температуры используется секция регулятора температуры. Нажмите на кнопку, чтобы включить его. Установите температуру на секции точки набора и нажмите введите.
Под этой кнопкой, Есть два графика. Красный показывает окончательный, температура порядка и желтый график показывает текущую температуру. Смешивая стоковые растворы, инъекция раствора кристаллизации в камеру резервуара контролируется секцией Palm.
Добавьте концентрацию раствора запаса на первом этапе. Затем найдите окончательную концентрацию каждого нового решения группера и добавьте их в окончательный раздел концентрации. После нажатия кнопки расчета, выяснить объем запасного раствора будет рассчитан и добавит в объем панели перед каждой концентрационой панели.
Нажмите кнопку подготовки запуска и подождите, пока новое решение премьера будет готово. Для обмена решением кристаллизации нажмите кнопку «Вход решений». Для остановки процесса нажмите кнопку Stop Distribution.
На правой стороне раздела микроскопа, Есть несколько панелей для записи важной информации из каждого эксперимента роста кристалла. Добавьте соответствующее название белков, молекулярный вес и состояние кристаллизации в этом разделе. Определите имя для экспериментов, просто введя его на имя папки.
Из раздела nb изображений выберите количество изображений, которые должны быть сделаны в ходе эксперимента. Добавьте количество изображений и с панели справа выберите шкалу таймера. Нажмите на кнопку папки, чтобы открыть папку.
В этой папке есть текстовый файл, содержащий всю информацию, которую вы ранее определили для вашего эксперимента. Изображения, готовые к дальнейшему лечению, также сохраняются в этой папке. Увеличить микроскоп также можно автоматически.
Изменяет масштабирование с помощью кнопки "плюс" и "минус" в верхней части раздела микроскопа, чтобы увеличить или уменьшить увеличение соответственно. Существует три различных способа измерения размера кристалла. Для измерения длины или ширины используйте вектор ширины.
В зависимости от формы кристалла можно выбрать конкретные инструменты из левой части раздела микроскопа. Например, прямоугольный или полигон. Значения будут отображаться в разделе измерения.
В первом наборе экспериментов кнопки микродиализа были погружены в растворы кристаллизации с различными концентрациями соли. В этом простом эксперименте сетки кристаллизации единственной переменной является пропасть концентрации. в то время как температура остается постоянной.
Незначительные колебания концентрации соли позволяют исследовать схему фазы кристаллизации за счет увеличения концентрации соли с 0,7 до 1,2 увеличения объемной визуализации, а раствор в зоне нуклеации отохвается от метастабиальной зоны. Следовательно, наблюдается изменение размера и количества кристаллов с увеличением количества кристаллов и уменьшением их размера. В первом эксперименте с OptiCrys при данном экспериментальном состоянии, как только равновесие в диализной камере достигает, раствор кристаллизации находится в зоне нуклеации в непосредственной близости от метастабиальной зоны фазы кристаллизации диаграммы.
В результате на первом этапе эксперимента генерируется всего несколько ядер. Для того, чтобы сохранить рост кристаллов в метастабиальной зоне и контролировать процесс роста кристалла, температура была изменена с разными временными интервалами. Каждый раз, когда равновесие кристаллического раствора было завершено, температура была разнообразной.
Поэтому температура снизилась до 291 Кельвина, 288 Кельвина и, наконец, 275 Кельвина для поддержания роста выбранного кристалла в метастабиальной зоне. Результатом этого эксперимента является один большой кристалл, с объемом, необходимым для естественной макромолекулярной кристаллографии. Следующие два эксперимента демонстрируют обратимость контролируемых температурой диализных экспериментов для нуклеации, роста кристаллов, растворения и отрастания.
Во втором эксперименте с OptiCrys химический состав раствора кристаллизации был постоянным в ходе эксперимента и температура менялась. Начальная температура была установлена на уровне 291 Кельвина. Из-за высокой супернасыщения в камере кристаллизации появилось большое количество мелких кристаллов.
В соответствии с концепцией прямой растворимости белка, постепенно повышая температуру до 313 Кельвина, все кристаллы должны были растворяться. Наконец, понизив температуру до 295 Кельвина, второе нуклеацию началось в непосредственной близости от метастабийной зоны и позволило контролировать процесс нуклеации, что привело к формированию меньшего количества ядер. Дальнейший рост кристаллов позволил создать единую популяцию более крупных кристаллов.
В этом эксперименте изменение химического состава раствора кристаллизации при постоянной температуре приводит к получению равномерной популяции более крупных кристаллов. Состояние кристаллизации было похоже на предыдущий эксперимент. Растворение кристаллов было достигнуто путем постепенного снижения концентрации NaCl с 0,9 молара до нуля.
Снижение концентрации соли удерживает раствор в недонасыщенной зоне фазовой диаграммы, что приводит к растворению кристаллов. Затем в камеру резервуара был введен новый раствор кристаллизации с меньшей ионной прочностью, чем раньше. При такой стремительной концентрации появляется меньшее количество кристаллов и кристаллы достигают большего объема, чем раньше.
Здесь мы представили подробный протокол, описывающий подготовку образца и корректировку программного обеспечения управления для выращивания больших и высококачественных кристаллов для естественной макромолекулярной кристаллографии с использованием полностью автоматизированного инструмента, разработанного в нашей лаборатории. Эта пошаговая процедура была разработана и извлечь выгоду из знания схемы фазы кристаллизации, чтобы отделить нуклеацию и рост кристаллов. Кроме того, протокол для выращивания кристаллов с микроцитозом моделей также представлен с использованием кнопок макроцитоза в качестве альтернативы, когда OptiCrys не доступен.
В дополнение к стратегиям, которые я упомянул для OptiCrys изменения химического состава раствора кристаллизации и температуры и съемки должны быть сделаны вручную. Использование термической регулируемой вибрации для инкубатора для постоянной температуры требуется, что является критическим шагом в продемонстрированной методологии.
