Esta técnica facilita la visualización de encuentros con aductos de ADN marcados con antígenos replisómicos y puede extenderse a las interacciones de cualquier proteína con una estructura de ADN o lesión susceptible de inmunodetección. Este método se puede utilizar para evaluar las frecuencias de interacción dentro de las células individuales, en lugar de a través de una población, y permite la visualización de las interacciones dependientes del ciclo celular in situ sin dañar las células. Demostrando el procedimiento estará Ishani Majumdar, un post-doc del Laboratorio Seidman.
El día anterior al experimento, sembrar de 1,5 veces 10 a la quinta célula en dos mililitros de medio en placas de cultivo de fondo de vidrio de 35 milímetros pretratadas con solución adhesiva celular. Al día siguiente, reemplace el sobrenadante en cada plato con un medio suplementado con TMP de 37 grados Celsius Five micromolar Dig al 50 a 70% de cultivos celulares confluentes y devuelva las placas a la incubadora de cultivos celulares durante 30 minutos para permitir que el Dig TMP se equilibre. Mientras las células se están incubando, precaliente una caja UV a 37 grados centígrados.
Al final del equilibrio, transfiera las placas a la caja precalentada para exponer las células a una dosis de luz UVA de tres julios por centímetro cuadrado de cinco minutos y reemplace los sobrenadantes con dos mililitros de medio de cultivo fresco precalentado antes de devolver las placas a la incubadora de cultivo celular durante una hora. Al final de la incubación, lavar suavemente los cultivos con PBS y fijar las células con un mililitro de formaldehído al 0,1% en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lavar las células una vez con PBS antes de tratar las células dos veces con 80 microlitros de tampón de extracción del citoesqueleto suplementado con RNasa durante cinco minutos a temperatura ambiente por tratamiento para eliminar el citoplasma.
Después de la segunda incubación, lave las células con dos mililitros de PBS tres veces antes de fijar las células con un mililitro de formaldehído al 4% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la segunda fijación, lave las células tres veces con PBS como se demuestra, seguido de un tratamiento con un mililitro de metanol frío al 100% durante 20 minutos a menos 20 grados centígrados. Al final de la incubación, lave las células tres veces en dos mililitros de PBS, seguido de una incubación de 10 minutos en 80 microlitros de cinco milimolares Triton X-100 a cuatro grados centígrados.
Al final de la incubación, trate las células con 100 microlitros de cinco milimolares EDTA en PBS, complementado con un microlitro de 100 miligramos por mililitro de RNasa A durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, lave las células tres veces en PBS antes de almacenarlas en albúmina sérica bovina al 5% y suero de burro al 10% en PBS en una cámara húmeda durante la noche a cuatro grados centígrados. Para realizar un ensayo de ligadura de proximidad, agregue 40 microlitros de la solución de anticuerpos primarios de interés al centro de cada placa e incube las placas en la cámara húmeda durante una hora a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, lave las células tres veces con dos mililitros de PBST antes de agregar 40 microlitros de solución de sonda de PLA recién preparada a cada plato durante una incubación de una hora en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, lave las celdas con tres lavados de 10 minutos en dos mililitros de tampón A en una plataforma basculante a temperatura ambiente. Después del último lavado, agregue 40 microlitros de mezcla de ligadura recién preparada a cada plato para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados, seguido de tres lavados de dos minutos en el tampón A en la plataforma basculante.
Después del último lavado, agregue 40 microlitros de solución de amplificación recién preparada a cada placa para una incubación de 100 minutos a 37 grados centígrados en una cámara húmeda. Al final de la incubación, lave las celdas seis veces con tampón B fresco durante 10 minutos por lavado en la plataforma basculante. Después del último lavado tampón B, lave las células una vez con tampón B 0.01x durante un minuto a temperatura ambiente antes de etiquetarlas con los anticuerpos secundarios apropiados en la cámara húmeda durante 30 minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, lavar las muestras con tres lavados de 10 minutos en una plataforma basculante en PBST a temperatura ambiente antes de montarlas en un medio de montaje suplementado con DAPI. Dentro de los cuatro días posteriores al montaje, obtener imágenes de al menos 100 observaciones por muestra o células de condición en un microscopio de epifluorescencia o confocal, utilizando los mismos ajustes de exposición para muestras experimentales y de control. La etiqueta Dig se puede visualizar por inmunofluorescencia para revelar la presencia de enlaces cruzados entre hebras en todo el núcleo.
Para visualizar la interacción de los replisomas con los enlaces cruzados entre hebras, se puede aplicar PLA para visualizar la frecuencia de asociación de MCM5 y la etiqueta Dig, una hora después de la introducción de la reticulación entre hebras. Como el estrés de replicación activa la quinasa ATR, el PLA entre pMCM dos serina 108 y la etiqueta Dig también es positivo. Los resultados de PLA de núcleos individuales se pueden presentar en una reconstrucción tridimensional que permite la visualización de encuentros de replisomas de reticulación entre hebras en todo el núcleo.
El análisis de la bifurcación de replicación indica que los encuentros de reticulación entre cadenas demuestran un fenómeno de reinicio de replicación inesperado, ya que las proteínas del complejo GINS no exhiben señal PLA con los enlaces cruzados entre hebras. En contraste, el ensayo con CD 45 es positivo, lo que indica que la otra proteína de bloqueo se retiene. Cuando las células se incuban con un inhibidor de ATR, el reinicio se suprime por completo y los PLA GINS Dig son fuertemente positivos.
El tratamiento CSK+R es esencial para reducir la señal de fondo. Asegúrese de cubrir las placas con un adhesivo celular y prefijar con 0.1% FA o las células se desprenderán de la placa.
