Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para tomar muestras de las subcapas de membrana perivitellina de los huevos aviares para una investigación más profunda de su papel fisiológico en la reproducción de aves. El muestreo de la membrana perivitellina se ha optimizado en cada paso para limitar cualquier daño estructural y molecular. El protocolo se desarrolló aún más para la proteómica en profundidad.
Comience tomando muestras de la capa perivitellina o PL de un huevo recién colocado sin fertilizar. Rompe el huevo y usa un separador de huevos para separar la yema de la blanca. Retire la chalazae con pequeñas tijeras y enrolle la yema sobre un papel filtrante para eliminar la albúmina adherente que aparece como una estructura transparente pero visible.
Sumerja la yema en un cristalizador que contenga 10 mililitros Tris HCL a pH ocho que previamente se ha enfriado a cuatro grados Celsius y retire el área pl sobre el disco germinal dentro de una zona de un centímetro usando tijeras contundentes. Rompe el PL con pequeñas tijeras dentro del búfer, luego sujeta los dos bordes del PL roto con fórceps y quítalo de la yema. Enjuague el PL varias veces en baños de Tris HCL de 10 mililitros hasta que no haya rastro de yema visible.
Asegúrese de que el PL esté limpio, blanco y flotante en el búfer. Procese el PL para la separación de subcapas o proceda directamente a análisis bioquímicos. Para separar la OPL y la IPL, extienda toda la muestra con la OPL mirando hacia arriba en una placa de plástico Petri llena con 10 mililitros Tris HCL y cloruro de sodio de 50 mililitros y mantenla plana con el menor número posible de arrugas.
Determine la ubicación de los chalazae restantes que solo están conectados a la OPL. Luego corta todo el PL en trozos de unos dos por tres centímetros con pequeñas tijeras. Separe mecánicamente las dos capas con fórceps de punta ultra precisos bajo un microscopio diseccionador.
Almacene las muestras resultantes de IPL y OPL individualmente en microtubaros a 80 grados Celsius negativos hasta su uso posterior. Para realizar la solubilización primaria de proteínas, congele las muestras de IPL y OPL individualmente para eliminar el agua restante, luego corte aproximadamente un miligramo de cada muestra y colóquela dentro de un micro tubo limpio con una tapa de tornillo a prueba de fugas. Mantenga las muestras restantes en tubos bien cerrados para un almacenamiento prolongado a 20 o 80 grados celsius negativos.
Mezcle un miligramo de cada subcapa liofilizada con 400 microlitros de Tris de 50 mililitros a pH siete y 500 mililitros de cloruro de sodio. Utilice un molino mezclador dos veces durante cinco minutos a 30 Hertz para desintegrar las estructuras en micro partículas y facilitar la solubilización de las proteínas. Recoge 400 microlitros de las muestras en dos microtubaros limpios.
Para preparar las muestras para la electroforesis, agregue el búfer de muestra SDS-PAGE 5X a cada muestra de 400 microlitros y calentarlo a 100 grados Celsius durante cinco minutos. Cargue un máximo de 20 microgramos de proteínas en cada carril de un gel de poliacrilamida SDS de 4-20% degradado y realice la electroforesis a 120 voltios. Después de la electroforesis, retire el gel de las placas de vidrio y tírelo con la solución Coomassie Brilliant Blue durante 30 minutos, luego desprestece con una solución que consiste en 50% agua, 40% etanol y 10% ácido acético hasta que el fondo del gel aparezca de color azul claro.
Transfiera el gel a una placa de Petri que contenga agua desionizada para des-tinción y rehidratación. Las proteínas deben aparecer como bandas azules con un fondo transparente. El PL fue sometido a varios tampones para identificar condiciones que permiten una pérdida mínima de proteínas y una separación óptima de la subcapa.
Aquí se muestran proteínas liberadas a concentraciones variables de Tris, pH y cloruro sódico. Las dos subcapas resultantes fueron observadas bajo un microscopio diseccionador. La IPL es translúcida, mientras que la OPL es densa, nublada y blanquecina.
Después de la separación, OPL e IPL fueron liofilizados de forma independiente y su contenido proteico se disolvió por completo utilizando una combinación de molienda mecánica, un detergente anoónico, un agente reductor y ebullición. Las muestras mostraron perfiles electroforéticos distintos en un gel de poliacrilamida. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la separación de las subcapas es un paso crítico del procedimiento y debe realizarse utilizando un microscopio binocular en un búfer que contenga una concentración mínima de sal.
Para dilucidar aún más su función fisiológica respectiva, las muestras de subcapa de membrana perivitellina pueden analizarse para su caracterización histológica mediante microscopía electrónica y para estudios funcionales utilizando ensayos de imágenes y migración celular.
