El protocolo presentado permite cuantificar una amplia gama de lípidos en tejido animal. Es una herramienta fácil para estudiar los mecanismos lipídicos y también para identificar biomarcadores que indican toxicidad temprana en modelos animales. El método ofrece un perfil cuantitativo de más de 400 lípidos moleculares en 14 clases diferentes de lípidos en una amplia variedad de matrices de muestra con un tiempo de tendencia de 10 minutos por muestra.
Para comenzar, diluir la centrífuga alícuota 1 sobrenadante dos veces la concentración con tampón de bicarbonato de amonio. Después de preparar la curva estándar de albúmina sérica bovina, haga un vórtice de los tubos estándar y centrifugue los tubos a 18, 200 g durante 15 segundos a temperatura ambiente. De los tubos estándar preparados previamente, transfiera 6 microlitros cada uno de los espacios en blanco, los estándares y las muestras a una placa de fondo plano de 96 pocillos.
A continuación, agregue 250 microlitros del reactivo Bradford a cada pocillo usando una pipeta multicanal y mezcle. Después de incubar durante 5 minutos, mida la absorbancia a una longitud de onda de 595 nanómetros utilizando un lector de placas. Prepare tubos de 2 mililitros con 100 microlitros de solución de bicarbonato de amonio en cada tubo del blanco total en blanco y del blanco estándar interno y mantenga todas las muestras en hielo.
Preparar muestras de control de calidad, considerando que se coloca una muestra de control de calidad entre cada conjunto de 10 muestras. Agregue 10 microlitros de plasma humano agrupado a tubos de 2 mililitros, luego ingrese 10 microlitros de solución estándar interna en todas las muestras de estudio y control de calidad y en blanco estándar interno. Agregue 300 microlitros de mezcla de metanol butanol a menos 20 grados centígrados a cada muestra y agite a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador.
A continuación, agregue 300 microlitros de mezcla de acetato de etilo de heptano y agite a 450 g durante 10 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador, luego agregue 300 microlitros de mezcla de ácido ascético al 1% y agite durante 5 minutos a 450 g a temperatura ambiente en el termomezclador. Centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente y transferir 360 microlitros de la fase superior a un nuevo tubo autoblocante de 2 mililitros etiquetado como 2. Después de agregar 320 microlitros de acetato de etilo de heptano al tubo de fase acuosa etiquetado como 1, agitar a 450 g durante 5 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador, luego centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente como se demostró anteriormente.
Transfiera 320 microlitros de la fase superior y combínelos con la fracción del paso anterior en el tubo 2. Del mismo modo, agregue 250 microlitros de acetato de etilo de heptano a la fase acuosa en el tubo 1 y agite a 450 g durante 5 minutos a temperatura ambiente en el termomezclador. Nuevamente, centrifugar a 2, 800 g durante 5 minutos a temperatura ambiente, luego transferir 200 microlitros de la fase superior y combinarlo con las fracciones de los pasos anteriores en el tubo 2.
Evaporar a sequedad a 35 grados centígrados en un concentrador de vacío y volver a disolver en 300 microlitros de solución de mezcla MS. Vortex cada tubo durante 5 segundos para asegurarse de que todo se disuelva y centrifugar a 18, 200 g durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Transfiera una alícuota de 50 microlitros a la placa de microlitros para el análisis del modo de ionización positiva y diluya con 50 microlitros de solución de mezcla MS.
Nuevamente, diluya con 80 microlitros de mezcla MS y transfiera una alícuota de 20 microlitros a la placa MTP para el análisis del modo de ionización negativa. Envuelva la placa con papel de aluminio y manténgala a 4 grados centígrados antes del análisis. Calibre un MS tanto en modo positivo como negativo de acuerdo con las instrucciones del fabricante 5 días o menos antes del análisis.
Instale la nanofuente de infusión directa por adelantado, asegurándose de que esté correctamente alineada contra el capilar de transferencia del MS y un chip de boquilla de 4.1 micrómetros en el soporte del chip, luego verifique los parámetros de infusión positiva y negativa correspondientes a una presión de gas de 1.25 psi, voltaje de fuente de 1.1 kilovoltios, 5 microlitros de volumen de inyección de muestra, cierre de contacto de salida Rel1 durante 2,5 segundos, 5 minutos de tiempo de entrega, enfriamiento de la placa a 4 grados centígrados, luego configure el controlador de temperatura y cree una nueva placa. Para el modo positivo, verifique y ajuste el software que el método MS esté configurado con una temperatura capilar de 250 grados centígrados y el nivel de RF de la lente S a 65.0. En el software Xcalibur, abra el método positivo y verifique que la adquisición de MS de escaneo completo esté configurada de cero a 1 minuto en el rango de 550 a 1, 000 m / z a una resolución de 140, 000 con control de ganancia automatizado de 1 millón y tiempo máximo de inyección de 50 milisegundos.
Aplique una masa de bloqueo de 680.48022. Compruebe que el método de adquisición MS/MS independiente de los datos está configurado entre el intervalo de tiempo de 1 y 5 minutos a una resolución de 17.500 con una primera masa fija de 250 m/z. Compruebe que el control de ganancia automatizado para MS2 esté configurado en 100, 000 y un tiempo máximo de inyección en 64 milisegundos, una energía de colisión de 20 NCE, la ventana de aislamiento a 1 m / z y que se use una lista de masa de inclusión de 398 a 1, 100 m / z con un paso de masa de 1 Dalton.
Para la adquisición en modo negativo, compruebe en el software de ajuste que el método MS está configurado con la temperatura capilar a 250 grados centígrados en el nivel de RF de lente S a 65.0 en el archivo de sintonización MS. A continuación, en el software Xcalibur, verifique que el modo de adquisición de escaneo completo esté configurado de cero a 1 minuto con una resolución de 140, 000 que cubra el rango de 400 a 940 m / z, control de ganancia automatizado de 1 millón, tiempo máximo de inyección de 200 milisegundos y una masa de bloqueo de 526.46262. Compruebe que la adquisición MS2 en modo DIA se configura entre 1 y 5 minutos de la carrera a una resolución de 17.500 con una primera masa fija de 150 m/z, control de ganancia automatizado de 100.000, 64 milisegundos de tiempo máximo de inyección y 35 NCE de energía de colisión utilizando la lista de masas de inclusión de 400 a 940 con un paso de masa de 1 Dalton.
Cree la cola de secuencia de análisis en el software Xcalibur en modo positivo y actívelo, luego cree la secuencia en el software ChipSoft e inicie el análisis mientras espera que la adquisición de la muestra se active mediante una señal de cierre de contacto proveniente del robot de infusión directa para cada muestra. Cuando se complete el análisis de modo positivo, cree la cola de secuencia de análisis en el software Xcalibur en modo negativo y actívelo, luego cree la secuencia en el software ChipSoft e inicie el análisis mientras espera que la adquisición de la muestra se active mediante una señal de cierre de contacto proveniente del robot de infusión directa para cada muestra. Se identificó y cuantificó la concentración total normalizada de lípidos a partir de las 14 clases de lípidos más abundantes, que fue ligeramente elevada para las clases de lípidos PE, PEO, PC, PCO, PI y PG y se observó cierta regulación a la baja para los lípidos SM, LPE y PA.
Si bien no se pudo ver ninguna diferencia para TAGs y PS. Estos resultados también muestran que, entre las características moleculares basadas en la fórmula molecular total, de 100 a 120 compuestos se vieron significativamente afectados por la exposición al humo del cigarrillo. La deconvolución de la fragmentación MS2 y la normalización de las intensidades de señal del fragmento permitieron la definición aproximada de la cantidad total de cada ácido graso conjugado representado en cada vidrio lipídico y la comparación de estos datos entre los grupos expuestos y control. Se observó una disminución en los ácidos grasos totalmente saturados y pocos insaturados, mientras que los ácidos grasos poliinsaturados en la composición de las clases de fosfolípidos PC, PE y PG se elevaron en el grupo de humo de cigarrillo para todos los puntos temporales.
Los casos extremos de PC y PG conjugados con ácido eicosapentaenoico y docosahexaenoico se detectaron exclusivamente en el grupo de exposición a 3R4F CS. El pipeteo de la muestra y la muestra de control de calidad debe hacerse con puntas de banda baja y ser precisas, lo que significa que las puntas deben verificarse entre cada muestra. El pipeteo de la solución estándar interna es crítico y debe ser preciso.
La solución de 1 a 1 diclorometano metanol debe manejarse con cuidado y se debe usar un no plastificante que contenga puntas para evitar que haya polímeros plásticos en las muestras. Las puntas deben cambiarse entre cada muestra.
