La ciencia morfológica y la calidad de las células, los gránulos de almidón y los cuerpos proteicos en el núcleo determinan el peso y la calidad de la semilla. En este estudio, presentamos como una población simple de un núcleo entero incrustado en resina LR White y establecemos un método simple de succión en seco de granos enteros. Elegimos la resina LR White como medio incrustado por dos razones principales.
En primer lugar, es de baja viscosidad y fuerte permeabilidad, lo que lleva a sus buenas aplicaciones en la preparación de estas poderosas secciones de semillas, especialmente para granos maduros de cereales con un gran volumen y alto contenido de almidón. En segundo lugar, la muestra incrustada en resina LR White se puede teñir fácilmente con muchos tintes químicos para exhibir claramente la morfología de las muestras bajo luz con microscopio fluorescente. Las secciones preparadas se pueden teñir específicamente para exhibir las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos claramente en la aparición de kernel entero, y los parámetros de morfología también se pueden analizar cuantitativamente.
El método contiene estudios. Aquí, utilizamos granos de maíz maduros con mayor volumen y alto contenido de almidón como muestra para exhibir los procesos paso a paso. Para empezar, recorta los granos en una botella simple.
Añadir unos 10 milímetros de 2,5% glutaraldehído con búfer de fosfato. un pH más 7.2 y colóquelo a 4 grados centígrados durante 48 horas para fijar ambos. A continuación, saque estos granos y los corte longitudinal o transversalmente, con dos a tres milímetros de espesor.
Necesitas una hoja afilada de doble cara. Y arréglalos por otras 48 horas. A continuación, lave las muestras tres veces con unos 10 milímetros, por lo que 0,1 M tampón de fosfato, pH 7,2 durante 30 minutos cada vez.
Para hidratar las muestras paso a paso, remojarlas en unos 10 milímetros de 30%solución acuosa de etanol durante 30 minutos primero, y sucesivamente remojarlas en 10 milímetros, por lo que 50%70%90% una vez, y 100%tres veces. Para infiltrarse en una muestra paso a paso, recuperarlos sucesivamente con 10 milímetros de solución de resina LR White diluida con etanol de 25%50%75% una vez, y 100%dos veces a cuatro grados centígrados durante 12 horas cada vez. Antes de incrustar, necesitamos preparar los pedestales para las muestras.
Añadir 250 microlitros de resina lr blanca pura en tubo centrífugo de dos milímetros y polimerizarlo a seis grados centígrados durante 48 horas. A continuación, añadir sucesivamente 500 microlitros de resina blanca LR pura e infiltrar la muestra en el tubo de centrífuga con un pedestal. Después de enderezar las muestras con aguja anatómica, poner la resina a seis grados centígrados en un horno durante 48 horas.
Saque los granos incrustados del tubo de centrífuga y corte el exceso de resina alrededor de una muestra usando una cuchilla afilada. Coloque el bloque de resina en el soporte de muestra de microtono y recorte la resina superflua en la superficie de la muestra y alrededor de la muestra con la hoja. Pulir aún más la superficie de la muestra finalmente con un cuchillo de vidrio hasta que se pueda formar una sección completa.
Ahora es el momento de preparar esta increíble sección con dos micras de espesor. Antes de cortar, coloque un pequeño cobre habló unos dos milímetros por encima del borde de la hoja para evitar que una sección se enrosque. A medida que la sección se alarga, ponga un spoke debajo de la sección para apoyarlo.
A continuación, agregue los 100 microlitros de agua en el tobogán no proligido y transfiera cuidadosamente la sección completa e ininterrumpida al agua con los tratantes. Calentar y secar a 50 grados centígrados para suavizar la sección arrugada. Por último, dos consejos importantes necesitan atención.
En primer lugar, si la sección se desmorona o se desgarra, extienda el tiempo para cada infiltración de resina de la muestra. En segundo lugar, si la sección tiene algunas líneas paralelas al cuchillo, sujete el bloque de muestra firmemente. Si la sección tiene algunas líneas verticales al cuchillo, por favor use un cuchillo nuevo.
Para observar la morfología de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos, podemos manchar las secciones con aclarador fluorescente 28, solución de yodo, y Coomassie azul brillante R250 respectivamente. Para otras manchas específicas, base en la investigación de la propuesta. Aquí utilizamos solución de yodo para manchar gránulos de almidón como ejemplo.
Añadir 40 microlitros de solución de yodo para sumergir la sección. Y guárdalo en el frasco por un minuto. Y luego cubra la muestra con una funda.
Y borrar el exceso de solución de agente a su alrededor. Observe y fotografíe la muestra inmediatamente bajo un microscopio iluminado equipado con una cámara CCTV. Podemos procesar y analizar cuantitativamente las imágenes fotografiadas para el área, el acceso largo o corto, y la redondez de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos en diferentes regiones para el uso del software de análisis de morfología.
Establecemos un método de seccionamiento seco simple para retener secciones de tamaño de kernel entero en resina LR White. El método puede preparar secciones transversales y longitudinales de todo el núcleo con dos micras. o ejemplos, la semilla entera madura de la colza se puede secuescionar transversal y longitudinalmente.
Las secciones de un grano entero maduro de maíz con mayor volumen también se pueden preparar con éxito. Además, el núcleo en desarrollo, el núcleo cocido y el núcleo germinado también se pueden investigar utilizando el método. Las secciones preparadas de kernels enteros tienen las siguientes aplicaciones.
En primer lugar, las secciones de todo el núcleo se pueden utilizar para observar la estructura tisular de las semillas. Por ejemplo, las secciones de embrión entero de colza manchada de safranina pueden exhibir claramente que es radical, hiper casual, interior y externo Las secciones de todo el núcleo se pueden utilizar para observar y analizar la morfología de las células. Por ejemplo, las secciones transversales de embrión entero de colza se tiñen con brillo fluorescente 28, y los aceites celulares se tiñen específicamente.
La micro morfología de las células en cualquier región de embrión entero se puede mostrar con un alto aumento. Los parámetros morfológicos de las células parénquimales, se pueden analizar cuantitativamente utilizando software de análisis de morfología y mostrar algunas diferencias en diversas regiones del embrión. Las secciones transversales de grano entero de maíz teñido con brillo fluorescente 28 también pueden exhibir como morfología de las células, y los parámetros morfológicos de las células son diferentes en diversas regiones de endospermo.
secciones de grano entero se pueden teñir con solución de yodo para exhibir su morfología de gránulos de almidón, por ejemplo, las secciones transversales y longitudinales de los granos de maíz teñidos con yodo pueden exhibir su morfología de gránulos de almidón claramente. Los gránulos de almidón en diversas regiones muestran una morfología, tamaño y cantidad significativamente diferentes en las células de endospermo. Así que el análisis cuantitativo de los parámetros morfológicos de los gránulos de almidón muestra que son significativamente diferentes en diversas regiones para el endospermo.
Las secciones se pueden utilizar para observar y analizar la morfología de los cuerpos proteicos. Por ejemplo, la proteína de almidón se tiñe de azul usando Coomassie azul brillante R250. La distribución espacial de la proteína de almidón en todo el embrión de la colza se puede observar en su bajo aumento, y la micro estructura se puede exhibir claramente con un alto aumento.
Además, los parámetros de índice de errores de números y morfología de los cuerpos proteicos en las regiones elegidas también se pueden analizar cuantitativamente. Esta técnica proporciona la primera y sencilla preparación de secciones de resina de granos enteros a partir del desarrollo y las semillas maduras. Las aplicaciones seccionales en la estructura tisular de todo el núcleo y luego investigar la morfología de las células, gránulos de almidón y los cuerpos proteicos en diferentes regiones de un núcleo entero.
Las imágenes adquiridas se pueden analizar cuantitativamente para mostrar los parámetros morfológicos de las células, gránulos de almidón y cuerpos proteicos y compararlos en diferentes regiones de kernel entero.
