Morfoloji bilimi ve hücrelerin kalitesi, nişasta granülleri ve çekirdekteki protein kütleleri tohumun ağırlığını ve kalitesini belirler. Bu çalışmada, LR White reçine gömülü bütün bir çekirdeğin basit bir popülasyonu olarak sunmakta ve bütün çekirdeklerin basit bir kuru emme yöntemini oluşturmaktadır. Biz iki önemli nedenden dolayı gömülü orta olarak LR Beyaz reçine seçin.
İlk olarak, düşük viskozite ve güçlü geçirgenlik, tohumbu güçlü bölümleri hazırlanmasında iyi uygulamalara yol açan, özellikle büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriği ile tahıl olgun çekirdekleri için. İkinci olarak, LR Beyaz reçine gömülü örnek floresan mikroskop ile ışık altında örneklerin morfolojisini açıkça sergilemek için birçok kimyasal boya ile kolayca boyanabilir. Hazırlanan kesitler, tüm çekirdeğin ortaya çıkmasında hücreleri, nişasta granüllerini ve protein gövdelerini açıkça sergilemek için özel olarak lekelenebilir ve morfoloji parametreleri de nicel olarak analiz edilebilir.
Yöntem çalışmalar içerir. Burada, süreçleri adım adım sergilemek için daha büyük hacimli ve yüksek nişasta içeriğine sahip olgun mısır çekirdeklerini örnek olarak kullanıyoruz. Başlamak için çekirdekleri basit bir şişeye bağlar.
Yaklaşık 10 milimetre ekleyin 2.5% fosfat-tamponlu glutaraldehit. bir daha pH 7.2 ve 4 derece santigrat 48 saat boyunca her ikisini de düzeltmek için yerleştirin. Daha sonra bu çekirdekleri çıkarıp 2-3 milimetre kalınlığında uzunlamasına veya transversyel olarak dilimleyin.
Keskin bir çift taraflı bıçağa ihtiyacın var. Ve onları 48 saat daha tamir edin. Daha sonra, yaklaşık 10 milimetre ile üç kez numuneleri yıkayın, böylece 0.1 M fosfat tampon, pH 7.2 30 dakika her zaman.
Örnekleri adım adım nemlendirmek için, önce %30 etanol sulu çözeltinin yaklaşık 10 milimetrelik kısmını ıslatın ve 10 milimetre ye, yani %50%70%90'ı bir kez ve %100 üç kez ıslatın. Bir numuneye adım adım sızmak için, 10 milimetrelik LR White reşin çözeltisi ile %25%50%75 oranında etanol ile seyreltilmiş ve her seferinde 12 saat boyunca dört derece santigratta %100 iki kez alın. Gömmeden önce, kaideleri numuneler için hazırlamamız gerekir.
İki milimetre centrifuge tüp içine saf LR Beyaz reçine 250 mikrolitre ekleyin ve 48 saat boyunca altı derece santigrat polimerize. Daha sonra, art arda saf LR Beyaz reçine 500 mikrolitre ekleyin ve bir kaide ile santrifüj tüpü içine örnek sızma. Anatomik iğne ile örnekleri düzleştirme sonra, 48 saat boyunca bir fırında altı derece santigrat resin koyun.
Santrifüj tüpünden gömülü çekirdekleri alın ve keskin bir bıçak kullanarak bir numunenin etrafındaki fazla reçineyi kesin. Rekarn bloğunu mikro ton numune tutucuya yerleştirin ve gereksiz rezorini numunenin yüzeyine ve bıçağın etrafına yerleştirin. Tam bir bölüm oluşturulana kadar numunenin yüzeyini cam bir bıçakla daha da parlata.
Şimdi iki mikron kalınlığında bu şaşırtıcı bölümü hazırlamak için zamanı. Dilimlemeden önce, bir bölümün kıvrılmasını önlemek için bıçağın kenarının yaklaşık iki milimetre üzerine küçük bir bakır koyun. Bölüm uzarken, onu desteklemek için bölümün altına bir spoke koyun.
Daha sonra, çıkıntısız slayt üzerinde su 100 mikrolitre ekleyin ve dikkatle tedavi ile suya tam ve kırılmamış bölümü aktarın. Isı ve 50 derece santigrat derecede buruşuk bölümü düzeltmek için kuru. Son olarak, iki önemli ipucu dikkat gerekir.
İlk olarak, bölüm parçalanırsa veya yırtılırsa, numunenin her reçine sızması için süreyi uzatın. İkinci olarak, bölüm bıçağa paralel bazı çizgiler varsa, örnek bloğu sıkıca kenetleyin. Bölümde bıçak için dikey bazı çizgiler varsa, yeni bir bıçak kullanın.
Hücrelerin morfolojisini gözlemlemek için, nişasta granülleri ve protein cisimleri, biz floresan parlatıcı 28, iyot çözeltisi ve Coomassie parlak mavi R250 sırasıyla kesitleri leke olabilir. Diğer özel lekeler için, teklif araştırma temel. Burada örnek olarak nişasta granülleri lekelemek için iyot solüsyonu kullanıyoruz.
Bölümü batırmak için 40 mikrolitre iyot çözeltisi ekleyin. Ve bir dakika kavanozda saklayın. Ve sonra bir kapak kol ile örnek kapağı.
Ve etrafındaki fazla ajan çözeltisini lekeleyin. Bir CCTV kamera ile donatılmış ışıklı bir mikroskop altında hemen gözlemlemek ve fotoğraf. Morfoloji analiz yazılımı kullanarak farklı bölgelerdeki hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin yuvarlaklığı, alan, uzun veya kısa erişim ve yuvarlaklığı için fotoğraflanan görüntüleri işleyebilir ve nicel olarak analiz edebiliriz.
LR White reçine tüm çekirdek büyüklüğündeki bölümleri korumak için basit bir kuru kesit yöntemi oluşturduk. Yöntem iki mikron ile tüm çekirdeğin enine ve uzunlamasına kesitleri hazırlayabilirsiniz. veya örnekler, yağlı tohum tecavüz olgun bütün tohum enine ve uzunlamasına kesitli olabilir.
Daha büyük hacimli olgun bir bütün çekirdek mısır bölümleri de başarıyla hazırlanabilir. Buna ek olarak, gelişmekte olan çekirdek, pişmiş çekirdek ve çimlenmiş çekirdek de yöntemi kullanılarak araştırılabilir. Tüm çekirdeklerin hazırlanan bölümleri aşağıdaki uygulamalara sahiptir.
İlk olarak, tohumdoku yapısını gözlemlemek için tüm çekirdek bölümleri kullanılabilir. Örneğin, safranin lekeli yağlı tohum tecavüzü tüm embriyo bölümleri açıkça bir radikal, hiper rahat, iç ve dış tüm çekirdek bölümleri gözlemlemek ve hücrelerin morfolojisi analiz etmek için kullanılabilir gösterebilir. Örneğin, yağlı tohum tecavüz tüm embriyo transversal bölümleri floresan parlatıcı ile boyanmış 28, ve hücre yağları özellikle boyanmış.
Tüm embriyoherhangi bir bölgede hücrelerin mikro-morfolojisi yüksek büyütme görüntülenebilir. Parankimal hücrelerin morfoloji parametreleri, morfoloji analiz yazılımı kullanılarak kantitatif olarak analiz edilebilir ve embriyonun çeşitli bölgelerinde bazı farklılıklar göstermektedir. Floresan parlatıcı 28 ile boyanmış tüm çekirdek transversal kesitler de hücrelerin morfolojisi olarak sergilenebilir, ve hücrelerin morfoloji parametreleri endosperm çeşitli bölgelerde farklıdır.
tüm çekirdeğin bölümleri nişasta granüllerinin morfolojisini sergilemek için iyot çözeltisi ile boyanabilir, örneğin, iyotla boyanmış mısır çekirdeklerinin transversal ve uzunlamasına bölümleri nişasta granüllerinin morfolojisini açıkça sergileyebilir. Çeşitli bölgelerde nişasta granülleri, endosperm hücrelerinde önemli ölçüde farklı morfoloji, boyut ve miktar gösterir. Nişasta granüllerinin morfolojik parametrelerinin kantitatif analizi, endosperm için farklı bölgelerde önemli ölçüde farklı olduklarını göstermektedir.
Bu kesitler protein kütlelerinin morfolojisini gözlemlemek ve analiz etmek için kullanılabilir. Örneğin, nişasta proteini Coomassie parlak mavi R250 kullanılarak mavi lekeli. Yağlı tohum tecavüz tüm embriyo nişasta proteininin mekansal dağılımı düşük büyütme görülebilir, ve mikro yapı yüksek büyütme açıkça sergilenebilir.
Buna ek olarak, seçilen bölgelerdeprotein cisimlerinin sayı hata indeksi ve morfoloji parametreleri de nicel olarak analiz edilebilir. Bu teknik, tüm çekirdeklerin reçine bölümlerinin gelişmekte olan ve olgun tohumlardan ilk ve basit hazırlanmasını sağlar. Tüm çekirdeğin doku yapısında kesitsel uygulamalar ve daha sonra hücrelerin morfolojisi araştırın, nişasta granülleri, ve bütün bir çekirdeğin farklı bölgelerinde protein organları.
Elde edilen görüntüler, hücrelerin, nişasta granüllerinin ve protein gövdelerinin morfoloji parametrelerini göstermek ve bunları tüm çekirdeğin farklı bölgelerinde karşılaştırmak için nicel olarak analiz edilebilir.
