מדע המורפולוגיה ואיכות התאים, גרגירי עמילן וגופי החלבון בגרעין קובעים את המשקל ואת איכות הזרעים. במחקר זה, אנו מציגים כאוכלוסייה פשוטה של גרעין שלם מוטבע שרף לבן LR ולהקים שיטת יניקה יבשה פשוטה של גרעינים שלמים. אנו בוחרים שרף לבן LR כמדיום מוטבע משתי סיבות עיקריות.
ראשית, זוהי צמיגות נמוכה וחזינות חזקה, מה שמוביל ליישומים הטובים שלה בהכנת קטעים חזקים אלה של זרעים, במיוחד עבור גרעינים בוגרים דגנים עם נפח גדול ותכלית עמילן גבוהה. שנית, המדגם מוטבע שרף לבן LR יכול להיות מוכתם בקלות עם צבעים כימיים רבים כדי להציג בבירור את המורפולוגיה של דגימות תחת אור עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. החלקים המוכנים יכולים להיות מוכתמים במיוחד כדי להציג את התאים, גרגירי עמילן, וגופי חלבון בבירור בהופעה של גרעין שלם, ואת הפרמטרים מורפולוגיה ניתן גם לנתח כמותית.
השיטה מכילה מחקרים. כאן, אנו משתמשים גרעיני תירס בוגרים עם נפח גדול יותר ותוכן עמילן גבוה כדגימה כדי להציג את התהליכים צעד אחר צעד. כדי להתחיל, קליפים גרעינים לתוך בקבוק פשוט.
הוסיפו כ-10 מילימטרים של גלוטראלדהיד עם אגירה של 2.5%. עוד pH אחד 7.2 ולמקום אותו ב 4 מעלות צלסיגרד במשך 48 שעות כדי לתקן את שניהם. ואז להוציא את הגרעינים האלה לחתוך אותם אורך או רוחבי, עם עובי של שניים עד שלושה מילימטרים.
אתה צריך להב חד דו-צדדי. ולתקן אותם לעוד 48 שעות. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות שלך שלוש פעמים עם כ 10 מילימטרים, כך 0.1 M פוספט חיץ, pH 7.2 במשך 30 דקות בכל פעם.
כדי לחות את הדגימות צעד אחר צעד, להשרות אותם על 10 מילימטרים של 30%אתנול פתרון מים במשך 30 דקות הראשון, ברציפות להשרות אותם 10 מילימטרים, כך 50%70%90% פעם אחת, ו 100%שלוש פעמים. כדי לחדור מדגם צעד אחר צעד, ברציפות לאחזר אותם עם 10 מילימטרים של פתרון שרף לבן LR מדולל עם אתנול של 25%50%75%פעם אחת, ו 100%פעמיים בארבע מעלות צל"ש במשך 12 שעות בכל פעם. לפני ההטבעה, אנחנו צריכים להכין את הדוכן לדגימות.
הוסף 250 microliters של שרף לבן LR טהור לתוך צינור צנטריפוגה שני מילימטרים ולהפוך אותו בשש מעלות צלחים במשך 48 שעות. לאחר מכן, להוסיף ברציפות 500 microliters של שרף LR לבן טהור לחדור את המדגם לתוך צינור צנטריפוגה עם הכן. לאחר יישר את הדגימות עם מחט אנטומית, לשים את הרף בשש מעלות צלסיגרד בתנור במשך 48 שעות.
מוציאים את הגרעינים המוטבעים מצינור הצנטריפוגה וחותכים שרף עודף סביב דגימה באמצעות להב חד. מניחים את בלוק שרף במחזיק מדגם של מיקרוטון לקצץ את שרף מיותר על פני השטח של המדגם סביב המדגם עם הלהב. עוד ללטש את פני השטח של המדגם סוף סוף עם סכין זכוכית עד קטע שלם יכול להיווצר.
עכשיו הגיע הזמן להכין את החלק המדהים הזה עם עובי של שני מיקרון. לפני חיתוך, לשים נחושת קטנה דיבר על שני מילימטרים מעל קצה הלהב כדי למנוע קטע קרלינג. ככל שהסעיף מתארך, שים את הדובר תחת הסעיף כדי לתמוך בו.
לאחר מכן, מוסיפים את 100 המיקרוליטרים של המים על המגלשה הלא מוכחת ומעבירים בזהירות את החלק המלא והבלתי שבור למים עם המטפלים. מחממים ומייבשים אותם ב-50 מעלות צלסיאדה כדי להחליק את החלק המקומט. לבסוף, שני טיפים חשובים זקוקים לתשומת לב.
ראשית, אם החלק מתפורר או דמעות, להאריך את הזמן עבור כל חדירת השרף של המדגם. שנית, אם הקטע יש כמה קווים מקבילים לסכין, להדק את בלוק המדגם בחוזקה. אם בסעיף יש כמה קווים אנכיים לסכין, אנא השתמש בסכין חדשה.
כדי לבחון את המורפולוגיה של תאים, גרגירי עמילן וגופי חלבון, אנו יכולים להכתים את החלקים עם מבהיר פלואורסצנטי 28, תמיסת יוד, ו- R250 כחול מבריק קומאסי בהתאמה. עבור כתמים ספציפיים אחרים, לבסס אותו על מחקר ההצעה. כאן אנו משתמשים בתווית יוד כדי להכתים גרגירי עמילן כדוגמה.
הוסף 40 מיקרוליטרים של פתרון יוד כדי לטבול את החלק. ותשמור את זה בצנצנת לדקה אחת. ואז לכסות את הדגימה עם שרוול כיסוי.
ולנתק את פתרון הסוכן העודף סביבו. צפו וצילמו את הדגימה מיד תחת מיקרוסקופ מדליק המצויד במצלמת טלוויזיה במעגל סגור. אנו יכולים לעבד ולנתח כמותית את התמונות המצולמות עבור שטח, גישה ארוכה או קצרה, ועגולות של תאים, גרגירי עמילן וגופי חלבון באזורים שונים עבור ליבה באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה.
אנו קובעים שיטת ניתוח יבשה פשוטה לשמירה על מקטעים שלמים בגודל ליבה שרף LR לבן. השיטה יכולה להכין חלקים רוחביים ואורך של הקרנל כולו עם שני מיקרון. או דוגמאות, הזרע הבוגר כולו של אונס זרעי שמן יכול להיות חתוך רוחבי ואורך.
ניתן להכין בהצלחה גם את החלקים של גרעין שלם ובוגר של תירס עם נפח גדול יותר. בנוסף, את הקרנל המתפתח, הקרנל מבושל, ואת הקרנל נבט ניתן גם לחקור באמצעות השיטה. הסעיפים המוכנים של גרעינים שלמים כוללים את היישומים הבאים.
ראשית, החלקים של הקרנל כולו ניתן להשתמש כדי לבחון את מבנה הרקמה של זרעים. לדוגמה, החלקים של עובר שלם של אונס זרעי שמן מוכתמים ספרנין יכול בבירור להציג את זה רדיקלי, היפר מזדמנים, פנימיים וחצוניים החלקים של הקרנל כולו ניתן להשתמש כדי להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של תאים. לדוגמה, החלקים רוחביים של עובר שלם של אונס שמן מוכתמים בבהירות פלואורסצנטי 28, ושמני התא מוכתמים במיוחד.
המיקרו-מורפולוגיה של תאים בכל אזור של עובר שלם יכולה להיות מוצגת בהגדלה גבוהה. הפרמטרים המורפולוגיים של תאים פרנצ'ימליים, ניתן לנתח כמותית באמצעות תוכנת ניתוח מורפולוגיה ולהראות כמה הבדלים באזורים מגוונים של העובר. החלקים הרוחביים של גרעין שלם של תירס מוכתם בבהירות פלואורסצנטית 28 יכולים גם להציג כמורפולוגיה של תאים, ופרמטרים מורפולוגיה של תאים שונים באזורים מגוונים של אנדוספרם.
קטעים של גרעין שלם יכולים להיות מוכתמים בתווית יוד כדי להציג את המורפולוגיה של גרגירי עמילן, למשל, הקטעים רוחביים ואת החלקים האורך של גרעיני תירס מוכתמים ביוד יכול להפגין מורפולוגיה של גרגרי עמילן בבירור. גרגירי עמילן באזורים מגוונים מראה מורפולוגיה שונה באופן משמעותי, גודל, וכמות בתאי אנדוספרם. אז ניתוח כמותי של פרמטרים מורפולוגיים של גרגירי עמילן מראה כי הם שונים באופן משמעותי באזורים מגוונים עבור אנדוספרם.
ניתן להשתמש בחלקים כדי להתבונן ולנתח את המורפולוגיה של גופי החלבון. לדוגמה, חלבון עמילן מוכתם בכחול באמצעות R250 כחול מבריק קומאסי. ההתפלגות המרחבית של חלבון עמילן בכל העובר של אונס שמן ניתן לראות בהגדלה נמוכה, ואת מבנה מיקרו ניתן להציג בבירור בהגדלה גבוהה.
בנוסף, ניתן לנתח כמותית את מדד השגיאות ואת הפרמטרים המורפולוגיים של גופי החלבון באזורים שנבחרו. טכניקה זו מספקת את ההכנה הראשונה והפשוטה של חלקי השרף של גרעינים שלמים מזרעים מתפתחים ובוגרים. היישומים החלקיים במבנה הרקמות של הקרנל כולו ולאחר מכן חוקרים את המורפולוגיה של תאים, גרגירי עמילן וגופי החלבון באזורים שונים של גרעין שלם.
ניתן לנתח את התמונות הנרכשות באופן כמותי כדי להראות את הפרמטרים המורפולוגיים של תאים, גרגירי עמילן וגופי חלבון ולהשוות אותם עוד יותר באזורים שונים של גרעין שלם.
