Los enfoques proteómicos dirigidos se están convirtiendo rápidamente en el método de elección para la validación de proteínas de experimentos basados en proteómica a corto plazo o de experimentos basados en biología molecular. El monitoreo de reacciones múltiples es uno de esos enfoques específicos que se utiliza cada vez más para detectar y cuantificar proteínas a partir de muestras biológicas. En este estudio hemos recorrido los diversos pasos involucrados en la detección y cuantificación de proteínas del tejido cerebral humano con la intención de presentar a los lectores los requisitos básicos de un experimento de MRM.
Pesar alrededor de 50 mg de tejido cerebral y lavar el tejido con 300 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1x. Este paso se realiza para eliminar cualquier sangre en la superficie externa del tejido, y por lo tanto es aconsejable eliminar la mayor cantidad de sangre posible. Después de los lavados con PBS, agregue 300 microlitros de tampón de lisis al tubo que contiene el tejido.
Lise el tejido con un sonicador de sonda mientras mantiene el tubo en un baño de hielo. Continúe con la homogeneización del tejido utilizando un batidor de cuentas para lisar completamente el tejido. Centrifugar el contenido del tubo a 6000 g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Transfiera el sobrenadante a un tubo fresco y mezcle homogéneamente. Tome una pequeña alícuota del sobrenadante y cuantifique el contenido de proteína utilizando un ensayo de proteína estándar. Aquí mostramos un ejemplo de estimación de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.
Tome 50 microgramos de proteína en un tubo de microcentrífuga y reduzca el contenido agregando TCEP de tal manera que la concentración final sea de 20 milimolares. Incubar el contenido a 37 grados durante una hora. Después de la incubación, alquila las proteínas reducidas agregando yodoacetamida al tubo, de modo que la concentración final sea de 40 milimolares.
Incubar el tubo en la oscuridad durante 30 minutos. Ahora agregue Buffer B al tubo que contiene las proteínas reducidas y alquiladas de tal manera que la concentración final de urea sea inferior a un molar. Agregue tripsina en 1 como a 30 proporción de enzima a proteína e incube los tubos durante la noche a 37 grados con agitación constante.
Después de la digestión, concentre los péptidos digeridos en un concentrador de vacío. En este paso, los péptidos pueden reconstituirse y desalarse o almacenarse a menos 80 para su uso futuro. La desalinación, o limpieza de péptidos, es esencial antes de cargar las muestras en cualquier LC-MS MS. Las sales y otros contaminantes en la muestra pueden obstruir la columna y afectar la sensibilidad del instrumento a largo plazo.
Este proceso se puede realizar utilizando puntas o columnas C18 STAGE disponibles comercialmente. Aquí hemos representado el flujo de trabajo para la desaline de péptidos utilizando una punta C18 STAGE. Después de la desalinación, seque los péptidos en un concentrador de vacío.
Reconstituya estos péptidos limpios y proceda a la cuantificación utilizando el método Scopes. Para ello, cargue dos microlitros de la muestra en una placa de microgotas y calcule la concentración como se muestra en la diapositiva. La preparación de la lista de transición es un paso crucial en un experimento de SRM o MRM.
Una lista de transición contiene toda la información requerida por el espectrómetro de masas para monitorear la transición. Esto incluye los valores m por z del precursor y los iones del producto, la energía de colisión de la transición, la polaridad del instrumento y el rango de tiempo para la adquisición de datos. Prepare la lista de transición con Skyline.
Prepare un proteoma de fondo utilizando el archivo Human Proteome Fasta de UniProt y asegúrese de que esté seleccionado en la pestaña Fondo de Configuración de péptidos. En la pestaña Filtro, establezca una longitud mínima de 8 y una longitud máxima de 25. Continúe utilizando la configuración predeterminada si no hay otras modificaciones en los péptidos.
Una vez que se hayan realizado los ajustes de péptidos, haga clic en Configuración de transición. En la pestaña Filtro, establezca Cargas precursoras como 2 y 3. Establezca las cargas de iones como 1 y establezca los tipos de iones en y.
Los iones de producto se pueden seleccionar dependiendo de la elección del usuario. Deje todos los parámetros como predeterminados. Ahora inserte los ID de acceso de las proteínas diana seleccionadas.
Esto se puede hacer haciendo clic en la pestaña Editar y luego seleccionando Insertar y finalmente pegando los ID de adhesión. Los ID se asignarán a las proteínas en el proteoma de fondo y se creará una lista de transición basada en la configuración de péptido y transición establecida anteriormente. Exporte esta lista de transición.
Asegúrese de que el instrumento correcto está seleccionado haciendo clic en la opción desplegable Tipo de instrumento. En este caso, el instrumento es Thermo Altis. Dado que la lista de transición indefinida tiene demasiadas transiciones, mantenga un límite de solo 350 transiciones por lista y expórtela como varios métodos.
Se utiliza un sistema de disolvente binario. El disolvente A es 1% FA y el disolvente B es 80% ACN. Mantenga el caudal a 450 microlitros por minuto y el gradiente como se muestra.
Ajuste la temperatura del compartimento de la columna a 45 grados centígrados. Para obtener más detalles sobre la columna y el sistema LC, consulte el texto. Asegúrese de que la configuración de MS en su TSQ Altis sea la que se muestra aquí.
Importe una sola lista de transición para crear un nuevo método. Sugerimos mantener la resolución para el cuadrupolo 1 y el cuadrupolo 3 en 7. Estos se pueden optimizar aún más si es necesario.
Para garantizar la coherencia en las ejecuciones y, en consecuencia, la calidad de los datos, prepare la secuencia de ejecución como se muestra. Comience con un par de espacios en blanco, consulte el texto para la composición de la mezcla en blanco, seguido de un BSA de luz estándar de control de calidad de concentración conocida para monitorear cualquier variación en la respuesta diaria del instrumento. El control de calidad realizado debe ser justo antes de las muestras.
A continuación, alinee todas las muestras con espacios en blanco en el medio. Inyecte volúmenes iguales de cada muestra, lo que representa de 25 a 1 nanogramo de péptidos por inyección. Para hacer un método refinado, primero ejecute los métodos indefinidos en muestras enteras.
Importe los resultados en Skyline y compruebe manualmente cada péptido. Para cada péptido, seleccione un precursor que muestre picos consistentemente buenos en todas las muestras. Elimine los precursores y péptidos que no muestren buenos picos.
Asegúrese de que todos los picos estén anotados correctamente. Para seleccionar el pico correcto y refinar aún más las transiciones debajo de cada precursor, se puede usar una biblioteca. Una biblioteca es un conjunto de datos espectrales de MS-MS emparejados con péptidos y transiciones de los datos experimentales actuales.
Elija los picos que tengan valores DART P más cercanos a 1 y elimine las transiciones que no coincidan con la biblioteca. Un valor DART P denota qué tan buena es la coincidencia entre el pico experimental y el pico de la biblioteca. Después de una o dos rondas de optimización, una lista refinada estará lista.
Esta lista refinada se puede ejecutar para muestras individuales. Importe las carreras refinadas en Skyline y anote los picos correctamente. Utilice la ficha Anotación en Configuración del documento para anotar cuidadosamente cada ejemplo de la cuadrícula del documento.
Utilice la función Comparación de grupos para crear comparaciones entre la condición 1 y la condición 2 del experimento. Esto dará una tabla con valores de P ajustados y valores de cambio de pliegue entre los dos grupos. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que emplea el uso de MRM para detectar péptidos para las proteínas Apolipoproteína A-1, Vimentina y Nicotinamida fosforribosiltransferasa en muestras de tejido cerebral humano.
La optimización de varios parámetros, como el gradiente LC, el tiempo de permanencia, el tiempo de ciclo y la energía de colisión, puede influir en gran medida en el éxito de un experimento MRM. Creemos que esta técnica se puede utilizar para desarrollar patrones de biomarcadores con capacidad para distinguir entre diferentes condiciones clínicas y enfermedades.
