Nos gustaría agradecer a Shreya Shah por su revisión y consejo.

1. Configuración de preparación del fantasma Doppler (Figura 2A)
<ol><li>Conecte la bomba peristáltica, el depósito de líquido que imita la sangre, el amortiguador de pulsos y el fantasma de flujo Doppler con los tubos de plástico.</li>
	<li>Elija el canal con un diámetro de 4 mm.</li>
	<li>Programe la bomba para expulsar 720 ml/min de líquido durante 0,3 s y luego para expulsar 50 ml/min durante 0,7 s para imitar respectivamente las fases cardíacas de sistóle y diastole</li>
	<li>Ejecute la bomba y agite suavemente las tuberías para expulsar posibles burbujas de aire. NOTA: El operador puede elegir un diámetro de canal diferente y una velocidad de bombeo diferente, pero tendrá que asegurarse de que la secuencia de ultrasonido sea lo suficientemente rápida como para adquirir las velocidades de flujo más rápidas. Eq. 3 presentado más tarde puede ayudar a diseñar la secuencia.</li>
</ol>2. Configuración del escáner de ultrasonido Ultrarrápido (Figura 2A)
<ol><li>Conecte el escáner de investigación ultrarrápido al ordenador host con el enlace expreso PCI.</li>
	<li>Cambie el adaptador del transductor en el escáner de ultrasonido para que coincida con el conector de la sonda y, a continuación, conecte la sonda.</li>
	<li>Ejecute Matlab y active la licencia del escáner de ultrasonido. NOTA: Esta sección y lo siguiente asumen implícitamente el uso de un sistema Verasonics Vantage.</li>
</ol>3. Programación de secuencias de ultrasonido
<ol><li>Utilizando los scripts de ejemplos, diseñe una secuencia de "Modo B" (es decir, echografía) enfocada convencional que se utilizará para el posicionamiento de la sonda.<ol>
<li>Ajuste la profundidad de imagen a 50 mm.</li>
		<li>Ajuste la profundidad focal a 35 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con los scripts de ejemplos, diseñe una secuencia de ultrarrápido ultrarrápida.<ol>
<li>Ajuste la profundidad de imagen a 50 mm.</li>
		<li>Programa 3 ondas planas inclinadas a [-3,0,3] grados.</li>
		<li>Ajuste la frecuencia de repetición del pulso (PRF) a 12 kHz.</li>
		<li>Utilice 4 medio ciclos para la forma de onda de ultrasonido, con una frecuencia central dependiendo de la sonda utilizada. Aquí se asume una frecuencia central de 5,2 MHz.</li>
		<li>Establezca la duración total en 1 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Posicionamiento de la sonda y adquisición de datos
<ol><li>Aplique gel de ultrasonido en la lente de la sonda.</li>
	<li>Coloque la sonda en el fantasma y inicie la secuencia de ultrasonido del modo B.</li>
	<li>Localice el canal de interés. El líquido parece más oscuro que el tejido circundante. Coloque la sonda en vista longitudinal.</li>
	<li>Mantenga manualmente la sonda en la posición de interés.</li>
	<li>Finalice la secuencia del modo B e inicie el script de adquisición de secuencia ultrarrápida.</li>
</ol>5. Reconstrucción de imágenes (Figura 2B)
<ol><li>Una vez que la secuencia haya terminado, guarde los datos sin procesar (también llamados datos de radiofrecuencia, "RF").</li>
	<li>Inicie el script de reconstrucción de imágenes utilizando el software predeterminado del sistema de ultrasonido. Al final del proceso, se debe crear la matriz de datos IQ. NOTA: Los ecos de ultrasonido se registran en cada elemento de la sonda y para cada emisión/recepción, luego se almacenan en la matriz de datos rf. La reconstrucción de imágenes aplicó la ley de retardo apropiada a cada canal y da como resultado la llamada matriz "IQ" (En fase/cuadratura). La compleja matriz IQ tiene tres dimensiones: dos para el espacio (profundidad y anchura de la imagen) y una para el tiempo</li>
</ol>6. Filtrado de desorden (Figura 2C)
NOTA: Para los pasos 6-7, véase el script matlab proporcionado en el material suplementario.
<ol><li>Vuelva a formatear la matriz de cilindrado 3D (espacio x espacio x tiempo) en una matriz Casorati 2D (espacio x tiempo), denominada IQr.</li>
	<li>Calcule la descomposición del valor singular15 de IQr (Eq. 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ01v3.jpg"> Eq. 1</li>
	<li>Calcule la Matriz de Similitud Espacial C utilizando los vectores singulares espaciales U descritos por Baranger et al.18 (II, D) e identifique los límites subespaciales sanguíneos N.</li>
	<li>Utilice este límite N para filtrar los datos de CI como se describe en Demene et al.15 (II,C).</li>
</ol>7. Visualización del flujo y mediciones de velocidad (Figura 2C)
<ol><li>Calcular la potencia Doppler map PD mediante la integración de la envolvente de los datos filtrados IQt a lo largo de la dimensión temporal (Eq. 2). Las coordenadas 3D z, x y t son respectivamente la profundidad, anchura y dimensión temporal, nt y es el número de fotogramas adquiridos. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ02v5.jpg"> Eq. 2</li>
	<li>Muestre el mapa PD en escala logaritmo. Para establecer el rango dinámico, calcule el PD medio en una región fuera del canal y utilice este valor en dB como límite inferior del rango dinámico. Un rango dinámico típico es [-30, 0] dB.</li>
	<li>Defina una región circular de interés (ROI) en la imagen, que contenga de 1 a 30 píxeles.</li>
	<li>Promedia la señal IQf sobre los píxeles de ese ROI, para obtener un vector <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ03v2.jpg"> de nt puntos de tiempo.</li>
	<li>Calcule y muestre el espectrograma Doppler de <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ04v2.jpg"> , utilizando la magnitud cuadrada de la transformación fourier de tiempo corto (STFT).<ol>
<li>Establezca la ventana STFT en una ventana hann de 60 muestras.</li>
		<li>Establezca la superposición STFT en el 90% de la longitud de la ventana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Superponga la frecuencia central en cada punto de tiempo del espectrograma.</li>
	<li>Convierta los valores de frecuencia f en velocidades axiales de sangre vz utilizando la fórmula Doppler (Eq. 3). c0 es la velocidad del sonido en el medio y fTW la frecuencia central de la forma de onda de ultrasonido transmitida (aquí 5,2 MHz). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ05v4.jpg"> Eq. 3</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doppler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ueber das farbige Licht der Doppelsterne und einiger anderer Gestirne des Himmels. , (2020).</li><li>Bonnefous, O., Pesqu&#233;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+domain+formulation+of+pulse-Doppler+ultrasound+and+blood+velocity+estimation+by+cross+correlation.">Time domain formulation of pulse-Doppler ultrasound and blood velocity estimation by cross correlation.</a> Ultrasonic Imaging. 8 (2), 73-85 (2004).</li><li>Bercoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+compound+doppler+imaging:+Providing+full+blood+flow+characterization.">Ultrafast compound doppler imaging: Providing full blood flow characterization.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 58 (1), 134-147 (2011).</li><li>Evans, D. 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Sin conflicto de intereses

Varias variaciones son posibles alrededor del marco principal de este protocolo.
Problemas de hardware Si el usuario suministra su equipo host personalizado, la placa base y el caso del equipo deben tener una ranura PCI express disponible. La CPU también debe tener suficientes carriles PCIe para manejar todos los dispositivos.
Selección de sondas La sonda de ultrasonido (también denominada transductor) se elige de acuerdo c...

La ecografía es una de las técnicas de diagnóstico por imágenes más utilizadas en la práctica clínica y las actividades de investigación. La combinación de emisión de ondas de ultrasonido en los tejidos biológicos seguida de la grabación de los ecos en la espalda permite la reconstrucción de imágenes anatómicas, el llamado "Modo B". Este método está perfectamente adaptado para imágenes de tejidos blandos, como los tejidos biológicos, que normalmente permiten la penetración de ultrasonido de más de varios centímetros, con una velocidad de propagación de ≈1540 m/s. Dependiendo de la frecuencia central de la sonda de ultrasonido, se obtienen imágenes con una resolución de 30 μm a 1 mm. Además, es bien sabido que el movimiento de una fuente acústica, afecta a las características físicas de las ondas asociadas. Particularmente, el vínculo entre los cambios de frecuencia de una onda en relación con la velocidad de su fuente se describe como el efecto Doppler1, cuya manifestación más simple es el tono de la sirena cambiante de una ambulancia en movimiento. Las imágenes por ultrasonido han utilizado durante mucho tiempo este efecto físico para observar los glóbulos rojos en movimiento2,y propone una variedad de modos de diagnóstico por imágenes comúnmente etiquetados como "Imágenes Doppler". Estos modos permiten evaluar los flujos sanguíneos en aplicaciones y órganos muy diferentes, como el cerebro, el corazón, los riñones o las arterias periféricas.
Notablemente, la mayoría de los sistemas de ultrasonido disponibles actualmente se basan en la misma tecnología, conocida como ultrasonido convencional. Los principios subyacentes son los siguientes: un haz acústico insinifica el campo de visión y se barre a lo largo de la abertura del transductor de ultrasonido. Para cada posición de la viga, los ecos se graban y se convierten en una línea de la imagen final. Al mover progresivamente el haz a lo largo del transductor, todo el campo de visión se puede crear imágenes línea por línea(Figura 1,panel izquierdo). Esta estrategia estuvo bien adaptada a las limitaciones eléctricas y a la potencia informática que prevaleció hasta principios del siglo XXI. Sin embargo, tiene varios inconvenientes. Entre ellos, la velocidad de fotogramas final se limita a unos pocos cientos de imágenes por segundo por el proceso de escaneo de haz. En términos de flujo sanguíneo, esta velocidad de fotogramas relativamente baja afecta a las velocidades máximas de flujo que se pueden detectar, lo cual está dictado por los criterios de muestreo de Shannon-Nyquist3. Además, doppler convencional debe hacer frente a una compensación compleja. Con el fin de evaluar la velocidad del flujo sanguíneo en una región de interés particular (ROI), varios ecos procedentes de ese ROI tienen que ser registrados sucesivamente. Esto implica que el haz de ultrasonido se mantiene temporalmente en una posición fija. Cuanto más largo sea el conjunto de eco, mejor será la estimación de velocidad para ese ROI. Sin embargo, para producir una imagen completa del campo de visión, la viga debe escanear el medio. Por lo tanto, se puede detectar el conflicto entre estas dos restricciones: mantener la viga para evaluar con precisión la velocidad a lo largo de una línea, o mover el haz para producir una imagen. Los diferentes modos Doppler convencionales (es decir, Color Doppler o Pulse Wave Doppler) reflejan directamente esta compensación. Normalmente, el Doppler de color produce un mapa de flujo de baja fidelidad utilizado para localizar los recipientes4, y el Doppler de onda de pulso se utiliza para cuantificar con precisión el flujo en un recipiente previamente identificado5.
Estas dos limitaciones (baja velocidad de fotogramas y compensación de localización/cuantificación) se superan con técnicas emergentes de cuadros muy altas. Entre ellos, el enfoque de apertura sintética6 o la técnica de transmisión multilínea se pueden citar7. En este estudio, nos centramos en el llamado método de ultrasonido Ultrarrápido. Introducido hace dos décadas8,9,10, este método también se basa en la emisión / recepción de ultrasonidos, pero con un patrón radicalmente diferente. De hecho, en lugar de utilizar un haz centrado en el escaneo, las imágenes ultrarrápidas utilizan ondas planas u ondas divergentes, que son capaces de insonificar el campo de visión con una sola emisión. Después de esa emisión única, la electrónica asociada también es capaz de recibir y procesar el gran número de ecos procedentes de todo el campo de visión. Al final, una imagen se puede reconstruir a partir de un único patrón de emisión/recepción11 (Figura 1,panel derecho). Estas emisiones desenfocadas pueden tener una baja relación señal-ruido (SNR) debido a la propagación de la energía acústica. Esto se puede abordar emitiendo varias ondas planas tituladas (o ondas divergentes con diferentes fuentes) y añadiendo las imágenes resultantes. Este método se denomina "composición coherente"12. Surgen dos consecuencias importantes. En primer lugar, la velocidad de fotogramas sólo depende del tiempo de ultrasonido del vuelo y puede alcanzar valores típicos de 1 a 10 kHz. En segundo lugar, esto garantiza la continuidad de los datos en dimensiones espaciales y temporales, también denominada coherencia espaciotemporal. Por lo tanto, se rompe la compensación convencional de localización/cuantificación. Esta combinación de una alta velocidad de fotogramas y coherencia espaciotemporal tiene un tremendo impacto en la capacidad de detectar flujos sanguíneos con ultrasonido. En comparación con el ultrasonido convencional, ultrarrápido proporciona caracterización completa del flujo sanguíneo3. Prácticamente, el usuario tiene acceso al curso de tiempo de velocidad en cada píxel de la imagen, durante toda la duración de la adquisición (normalmente ≈1 s), con un escala de tiempo dado por la velocidad de fotogramas (normalmente, una velocidad de fotogramas de 5 kHz para una resolución temporal de 200 μs). Esta alta velocidad de fotogramas hace que el método sea adecuado para una amplia gama de aplicaciones como el flujo rápido en órganos móviles como cámaras cardíacas13 o miocardio con la microperfusión coronaria14. Además, se ha demostrado que su coherencia espaciotemporal mejora fuertemente su capacidad para separar el flujo sanguíneo lento de los tejidos en movimiento de fondo, aumentando así la sensibilidad al flujo micro-vascular15. Esta capacidad da acceso a la micro vasculatura del cerebro tanto en animales16 como en humanos17.
Por lo tanto, ultrasonido ultrarrápido es muy adecuado para el flujo sanguíneo de imagen en una variedad de situaciones. Se limita a los tejidos biológicos blandos y se verá fuertemente afectado por la presencia de interfaces duras como huesos, o cavidades de gas como el pulmón. La afinación de los parámetros físicos de la secuencia de ultrasonido permite el estudio de ambos lentos (hasta 1 mm/s11,16)y flujos rápidos (hasta varios m/s). Existe una compensación entre la resolución espacial y la profundidad de penetración. Normalmente, se puede lograr una resolución de 50 μm a costa de una penetración de alrededor de 5 mm. Por el contrario, la penetración se puede ampliar a 15-20 cm a costa de una resolución de 1 mm. Vale la pena señalar que la mayoría de los escáneres ultrarrápidos como el utilizado en este artículo sólo proporcionan imágenes 2D.
Aquí, proponemos un protocolo simple para introducir el concepto de imágenes Ultrafast Doppler, utilizando un escáner de ultrasonido de investigación programable y un fantasma Doppler imitando un vaso (arteria o vena) incrustado en tejido biológico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood-mimicking fluid</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>069DTF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doppler flow phantom</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>ATS523A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks, Natick, Massachusetts, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump / Doppler flow pump</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>769</td>
			<td>Include tubings and pulse dampener</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer adpter</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>UTA 408-GE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast ultrasound research scanner</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>Vantage 256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound probe/transducer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE 9L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blood flow imaging with ultrafast doppler

El efecto pulsed-Doppler es la principal técnica utilizada en la echografía clínica para evaluar el flujo sanguíneo. Aplicado con los modos doppler de ultrasonido enfocado convencional, tiene varios límites. En primer lugar, se necesita una operación de filtrado de señal finamente ajustada para distinguir los flujos sanguíneos de los tejidos en movimiento circundantes. En segundo lugar, el operador debe elegir entre localizar los flujos sanguíneos o cuantificarlos. En las últimas dos décadas, las imágenes por ultrasonido han experimentado un cambio de paradigma con la aparición de ultrasonido ultrarrápido utilizando ondas desenfocadas. Además de un aumento de cien veces en la velocidad de fotogramas (hasta 10000 Hz), esta nueva técnica también rompe el equilibrio convencional de cuantificación/localización, ofreciendo un mapeo completo del flujo sanguíneo del campo de visión y un acceso simultáneo a mediciones de velocidades finas en el nivel de un solo píxel (hasta 50 μm). Esta continuidad de datos en dimensiones espaciales y temporales mejora fuertemente el proceso de filtrado de tejido/sangre, lo que resulta en un aumento de la sensibilidad a velocidades de flujo sanguíneo pequeñas (hasta 1 mm/s). En este artículo de método, nuestro objetivo es introducir el concepto de ultrarrápido Doppler, así como sus principales parámetros. En primer lugar, resumimos los principios físicos de las imágenes de ondas desenfocadas. A continuación, presentamos los pasos principales de procesamiento de señal Doppler. En particular, explicamos la implementación práctica de los algoritmos críticos de separación de tejido/flujo sanguíneo y sobre la extracción de velocidades de estos datos filtrados. Esta descripción teórica se complementa con experiencias in vitro. Un fantasma tisú que incrusta un canal con fluido que imita la sangre se muestra con un sistema de ultrasonido programable de investigación. Se obtiene una imagen de flujo sanguíneo y las características de flujo se muestran durante varios píxeles en el canal. Por último, se propone una revisión de las aplicaciones in vivo, mostrando ejemplos en varios órganos como carótidos, riñón, tiroides, cerebro y corazón.

La calidad de la adquisición y el postprocesamiento se evalúan en primer lugar mediante inspección visual. La forma del canal debe ser claramente visible en la imagen de Doppler de potencia, y el área del tejido debe aparecer oscura. Si la señal Doppler de potencia no está restringida al canal, puede significar que el paso del filtro de desorden salió mal (el umbral SVD es demasiado bajo), o la sonda experimentó un movimiento fuerte durante la adquisición.
Después de la inspección v...

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Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Este protocolo muestra cómo aplicar imágenes doppler ultrarrápidas ultrarrápidas para cuantificar los flujos sanguíneos. Después de una adquisición larga de 1, el experimentador tiene acceso a una película del campo de visión completo con valores de velocidad axial para cada píxel cada ≈0,3 ms (dependiendo del tiempo de ultrasonido de vuelo).

Imágenes de flujo sanguíneo con Ultrafast Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

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Bioengineering

Unit 1

Sampling

Blood Vessels and Circulation

SCIENTISTS IN ACTION

7.2K vistas.  The Hospital for Sick Children, PGCRL Research Institute. Este protocolo muestra cómo aplicar imágenes doppler ultrarrápidas ultrarrápidas para cuantificar los flujos sanguíneos. Después de una adquisición larga de 1, el experimentador tiene acceso a una película del campo de visión completo con valores de velocidad axial para cada píxel cada ≈0,3 ms (dependiendo del tiempo de ultrasonido de vuelo).

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Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Investigación

Bioingeniería

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Localización y cuantificación relativa de nanotubos de carbono en las células con multiespectral de imágenes de Citometría de Flujo

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Método mejorado para la preparación de una base de células, Contacto Modelo Humano de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Detección Sensible de Proteopathic Siembra Actividad con FRET Citometría de Flujo

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

En Vitro Modelo de fisiológicos y patológicos de flujo de sangre con aplicación a las investigaciones de remodelado vascular celular

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Flujo de microfluidos Cámaras utilizando sangre reconstituida a Modelo Hemostasia y Transfusión de Plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Una Cámara de microfluidos Modelo de Flujo de Transfusión de Plaquetas y hemostasia Medidas de deposición de plaquetas y la formación de fibrina en tiempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a key hemodynamic parameter related to cerebral oxygen supply. Resting state low frequency fluctuations based on oxygenation contrast have been shown to provide correlations between functionally connected regions. The presented protocol uses optical diffuse correlation spectroscopy (DCS) to assess blood flow-based resting state functional connectivity (RSFC) in the human brain. Results of CBF-based RSFC in human frontal cortex indicate that intra-regional RSFC is significantly higher in the left and right cortices compared to inter-regional RSFC in both cortices. This protocol should be of interest to researchers who employ multi-modal imaging techniques to study human brain function, especially in the pediatric population.

This protocol demonstrates how to measure resting state functional connectivity in the human prefrontal cortex using a custom-made diffuse correlation spectroscopy instrument. The report also discuss practical aspects of the experiment as well as detailed steps for analyzing the data.

Conectividad funcional del cerebro humano basada en el flujo sanguíneo cerebral mediante espectroscopia óptica de correlación difusa

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caracterización de cambios de conformación de una sola molécula bajo flujo de cizallamiento con microscopía de fluorescencia

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.